I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Enzymatische Reaktion (Bild wird in einem neuen Fenster geöffnet)
Die pankreatische Ribonuklease (RNase) ist eine Endoribonuklease. Sie katalysiert die Spaltung der Phosphodiesterbindung zwischen der 5′-Ribose eines Nukleotids und der Phosphatgruppe an der 3′-Ribose eines benachbarten Pyrimidin-Nukleotids. Bei dieser Spaltung entsteht ein 2′,3′-zyklisches Phosphat, das dann zum entsprechenden 3′-Nukleosidphosphat hydrolysiert wird.
RNase findet sich in der größten Menge in der Pankrease von Wiederkäuern (Barnard 1969). Der Hauptbestandteil des kristallinen Enzyms ist RNase A; ein kleinerer Bestandteil ist RNase B. RNase B ist die glykosylierte Form von RNase A (Beintema et al. 1976).
Geschichte:
Die Arbeit von Jones aus dem Jahr 1920 wird gewöhnlich als der „Beginn“ der pankreatischen Ribonuklease bezeichnet (Richards und Wycoff 1971). Die RNase wurde 1938 von Dubos und Thompson isoliert und 1940 von Kunitz kristallisiert.
Im Jahr 1947 war Worthington das erste Unternehmen, das hochgereinigte kristalline RNase herstellte. In den frühen 1950er Jahren stellte die Firma Armour rohes kristallines Enzym her und bot es zu einem sehr günstigen Preis an. In den 1960er und 1970er Jahren war RNase A ein beliebtes Studienobjekt, vor allem weil es bemerkenswert thermostabil ist und in hoher Konzentration in einer leicht zugänglichen Quelle, dem Rinderpankreas, vorliegt. Diese Studien führten zur Aufklärung der Kristallstruktur (Anfinsen 1959, Groves 1966 und Scheraga 1967), zur Bestimmung der Aminosäuresequenz (Smyth et al. 1963), zur Identifizierung des katalytischen Mechanismus (Beers 1960) und zur Klärung der Faltungswege (Hantgan et al. 1974). RNase A war das erste Enzym und das dritte Protein, für das eine korrekte Aminosäuresequenz bestimmt wurde (Raines 1998).
Vier Nobelpreise wurden für Arbeiten im Zusammenhang mit Studien über RNase verliehen (Anfinsen, Moore, Stein und Merrifield). Die umfangreiche Literatur und die zahlreichen Studien haben die RNase zum am intensivsten untersuchten Enzym des 20. Jahrhunderts gemacht (Raines 1998).
In neueren Arbeiten wird die Synthese und Reifung der RNase im endoplasmatischen Retikulum lebender Zellen untersucht (Geiger et al. 2010). Auch die Faltung und Aggregation von RNase wird weiterhin intensiv erforscht (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008 und Arai et al. 2010). Die Rolle des Enzyms bei der Krebsentstehung und der Genregulierung wird untersucht (Shlyakhovenko 2009), und es wird als Chemotherapeutikum für Krebs entwickelt (Chao et al. 2010).
Spezifität:
RNase A ist spezifisch für Pyrimidin-Nukleosid-Bindungen (Volkin und Cohn 1953). Es wird angenommen, dass die Reaktion in zwei Schritten abläuft. Im ersten Schritt wird die 3′,5′-Phosphodiesterbindung gespalten, wobei ein 2′,3′-zyklisches Phosphodiester-Zwischenprodukt entsteht. Im zweiten Schritt wird der zyklische Phosphodiester zu einer 3′-Monophosphatgruppe hydrolysiert. Der erste Schritt ist unspezifisch in Bezug auf die Stickstoffbase des Substrats; der zweite Schritt ist jedoch absolut spezifisch für Pyrimidin-Nukleotide mit endständigen 2′,3′-cyclischen Phosphaten. RNase B hat die gleiche Spezifität wie RNase A sowohl für zyklisches Cytidylat als auch für Hefe-RNA (Plummer und Hirs 1963). RNase A zeigt eine Vorliebe für größere Substrate (Nogués et al. 1995).
Das Enzym spaltet an Cytidinresten doppelt so schnell wie an Uridylresten (Richards und Wyckoff 1971). Es hat sich gezeigt, dass Thr45 für die Vermittlung der Pyrimidin-Spezifität am wichtigsten ist, indem es sowohl Wasserstoffbrücken mit Pyrimidinbasen bildet als auch Purinbasen sterisch ausschließt (del Cardayré und Raines 1994). Die Seitenkette von Asp83 ist wichtig für die Stabilisierung des Übergangszustands während der Spaltung uridinhaltiger Substrate; dieser Rest hat keinen Einfluss auf die Kinetik der Cytidinspaltung (del Cardayré und Raines 1995).
Zusammensetzung:
Die Form des Proteins ähnelt einer Niere, wobei die Reste des aktiven Zentrums im Spalt liegen (Richardson 1981 und Raines 1998). Die Sekundärstruktur enthält lange viersträngige antiparallele Beta-Sheets und drei kurze Alpha-Helices (Raines 1998). RNase A enthält vier Disulfidbindungen, die für die Stabilität des nativen Enzyms entscheidend sind. Zwei dieser Disulfidbindungen liegen zwischen einer alpha-Helix und einem beta-Faltblatt und tragen mehr zur thermischen Stabilität bei als die beiden anderen (Klink et al. 2000). RNase B ist ein Glykoprotein, das an Asn34 ein einzelnes Oligosaccharid enthält, das sich aus sechs Resten Mannose und zwei Resten N-Acetylglucosamin zusammensetzt (Tarentino et al. 1970).
Molekulare Merkmale:
RNase A ist ein kleines Protein, das reife Enzym hat nur 124 Aminosäurereste, an die kein Kohlenhydrat gebunden ist. RNase A enthält 19 der 20 Aminosäuren, nur Tryptophan fehlt (Nogués et al. 1995, und Raines 1998). Die dreidimensionale Struktur der RNase A ist vollständig durch ihre Aminosäuresequenz kodiert (White und Anfinsen 1959, und Raines 1998). Alle acht menschlichen RNase A-ähnlichen Gene befinden sich auf Chromosom 14. Jedes kodiert eine sekretorische Signalsequenz und enthält eine unveränderliche katalytische Triade aus zwei Histidinen und einem Lysin mit einem konservierten Motiv (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Die Aminosäuresequenzen vieler RNase A-Homologe wurden identifiziert, was die RNase A zu einem Modellsystem für die molekulare Evolution der Wirbeltiere macht (Dyer und Rosenberg 2006). Anhand der Sequenzen und ihrer Verteilung über eine Reihe von Arten wurde festgestellt, dass RNase A ein modernes Protein ist, das sich schnell weiterentwickelt (Doolittle 1992 und Raines 1998).
Protein Accession Number: P61823
CATH-Klassifikation (v. 3.2.0):
- Klasse: Alpha-Beta
- Architektur: Rolle
- Topologie: P-30 Protein
Molekulargewicht:
- RNase A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B: 14,700 ± 0,3 (Plummer und Hirs 1963)
Optimaler pH-Wert: RNase A: 7,0-7,5 (Brown und Todd 1955)
Isoelektrischer Punkt:
- RNase A: 9,3 (Ui 1971)
Extinktionskoeffizient:
- RNase A und B: 8.640 cm-1M-1 (Theoretisch)
- RNase A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNase B: E 1%, 280 = 5.77 (Theoretisch, RNase B)
Reste der aktiven Stelle:
- Histidin (H12, H119)
- Lysin (K41)
Aktivatoren:
- Natriumchlorid (Weickmann et al. 1981)
- Sulfat (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitoren:
- Schwermetallionen
- Ribonuklease-Inhibitor (RI), ein 50 kDa Protein, das ≤ 0.01% des Proteins im Cytosol von Säugetierzellen ausmacht (Takahashi 1967)
- Uridin-Vanadat-Komplexe (Lindquist et al. 1973)
Anwendungen:
- RNA-Entfernung während der DNA-Isolierung
- RNA-Sequenzanalyse
- RNase-Schutz-Assays
- RNA-Quantifizierung oder -Mapping
- Reinigung von Plasmid-DNA
- Genomische DNA-Isolierung
- Molekulargewichtsmarker