7 RAG-Bindung genomweit
Angesichts der direkten DNA-Bindungseigenschaften von RAG1 in Kombination mit der einzigartigen Häufigkeit von RSSs in den Antigenrezeptor-Genen war es vernünftig anzunehmen, dass die Ortsspezifität der V(D)J-Rekombination einfach durch die bevorzugte Rekrutierung von RAG1 an seine bevorzugten DNA-Substrate erzwungen wird. RAG2 sollte aufgrund seiner PHD und seines Mangels an intrinsischer katalytischer Aktivität keine funktionellen Beschränkungen für seine Lokalisierungsmuster aufweisen. Dementsprechend bindet RAG2 im gesamten Lymphozytengenom und besetzt einen Großteil (~ 60 %) der aktiven TSSs, die mit H3K4me3 angereichert sind (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). RAG1 lokalisiert jedoch auch an Tausenden von Stellen (~ 3500 in Thymozyten und Prä-B-Zellen von Mäusen), die von RAG2 und H3K4me3 gemeinsam besetzt sind, was einen erheblichen Teil der hochaktiven, linienspezifischen Promotoren und Enhancer umfasst (Teng et al., 2015). Diese weit verbreitete Lokalisierung wird auch bei einer katalytischen Mutante von RAG1 (D708A) beobachtet, was darauf hindeutet, dass die weit verbreitete Bindung von RAG1 nicht auf eine Akkumulation nach der Spaltung zurückzuführen ist (Teng et al., 2015). Die RAG1-Bindungsstellen außerhalb von Antigenrezeptorgenen zeigten keine eindeutige Korrelation mit dem Vorhandensein von RSS-ähnlichen Motiven (kryptische RSS oder cRSS), was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass sequenzspezifische Kontakte und RAG-vermittelte Spaltungsaktivität die Muster der RAG1-Bindung im gesamten Genom nicht erklären können. Stattdessen sind Marker der Chromatin-Zugänglichkeit die besten Prädiktoren für die RAG1-Rekrutierung: H3K4me3, H3K27Ac, erhöhter GC-Gehalt und erhöhter CpG-Gehalt (Teng et al., 2015).
Tatsächlich gibt es nur eine Handvoll Beispiele, die eine spezifische RAG1-Rekrutierung an Antigenrezeptor-Gene über Transfaktoren zeigen, die sowohl mit RAG1 als auch mit spezifischen DNA-Motiven interagieren. In jedem Fall hängt die Lokusspezifität des Rekrutierungsereignisses nicht von der RSS an sich ab, sondern von einem Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv, das sich zufällig mit einer RSS überschneidet. Der Tcrb-Locus der Maus illustriert einen Fall, in dem die gezielte RAG1-Rekrutierung zu „beyond 12/23“-Restriktionen beiträgt, die helfen, die korrekte Reihenfolge der Rekombination aufrechtzuerhalten (Dβ-Jβ vor Vβ-DJβ). Die 3′ 23-RSSs, die Dβ1 und Dβ2 flankieren, enthalten konservierte Bindungsstellen für c-fos, eine Untereinheit des AP-1 Transkriptionsfaktors (Wang et al., 2008). Unabhängig von seinen transkriptionsaktivierenden Eigenschaften rekrutiert c-fos bevorzugt RAG1 zu den 3′ Dβ-RSSs und begünstigt so die Dβ-Jβ-Rekombination (Wang et al., 2008). In der B-Linie ist der analoge Antigenrezeptor-Locus das Igh-Gen, wo die direkte Vh-Dh-Rekombination im Vergleich zur Vh-DJh-Rekombination benachteiligt ist. In diesem Fall scheint die Reihenfolge der Rekombination jedoch durch lokale Verschiebungen der epigenetischen Markierungen reguliert zu werden, die auf die D-Jh-Rekombination folgen und das DJ-Produkt für eine bevorzugte RAG1-Bindung und Rekombination im Vergleich zu Keimbahn-Dh-Gensegmenten markieren (Subrahmanyam et al., 2012). Darüber hinaus wird die direkte Vh-Dh-Rekombination durch ein als IGCR1 bekanntes Sequenzelement unterdrückt, das zwischen den Genclustern D und V liegt (Guo et al., 2011). IGCR1 enthält zwei wichtige CTCF-Stellen und fungiert vermutlich als Ankerpunkt für Chromatinschleifen, die den DJ-Teil des Igh-Lokus vom V-Teil abtrennen (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). Der menschliche Tcrd-Lokus liefert ein weiteres Beispiel für eine lokusspezifische RAG1-Deposition, bei der die Runx1-abhängige RAG1-Rekrutierung an Dδ2 ein Dδ2-Dδ3-Umlagerungsereignis begünstigt, das der klassischen Dδ-Jδ-Rekombination vorausgeht (Cieslak et al., 2014). Dies führt zu einer humanspezifischen Einbeziehung von zwei D-Genabschnitten in Tcrd-Umlagerungen. Schließlich wurde vorgeschlagen, dass Pax5 mit RAG interagiert und die RAG-Rekrutierung an Vh-Gensegmente erleichtert (Zhang et al., 2006), obwohl noch nicht bewiesen wurde, dass dieser Mechanismus den Aufbau des endogenen Igh-Lokus fördert.
Abgesehen von diesen Ausnahmen scheint die RAG1-Bindung nicht primär durch sequenzspezifische Rekrutierungsereignisse ausgelöst zu werden. Sogar innerhalb der Tcr- und Ig-Gene geht die RAG1-Bindung über die RSS-Grenzen hinaus und nimmt intronische Regionen ein, die mit H3K4me3 angereichert sind, aber keine RSSs aufweisen (Teng et al., 2015). Das soll nicht heißen, dass die RSSs keine sekundären Rollen bei der Stabilisierung oder Verstärkung der RAG1-Bindung nach der Rekrutierung spielen. Die Tcra- und Igk-Gene sind die wichtigsten Rekrutierer der RAG1-Bindung in doppelt-positiven Thymozyten bzw. Prä-B-Zellen, und definierte Spitzen der RAG1-Akkumulation werden deutlich über den RSSs in Rekombinationszentren beobachtet (Teng et al., 2015). Die außergewöhnliche Dichte von RSSs in den Antigenrezeptorgenen ist wahrscheinlich eines der wichtigsten Merkmale, die sie vom Rest des Genoms unterscheiden.
Das Genom im Allgemeinen weist jedoch eine RSS-unabhängige RAG1-Rekrutierung auf, die wahrscheinlich durch unspezifische Wechselwirkungen zwischen RAG1 und DNA erfolgt, die durch verschiedene Domänen im RAG1-Kern, einschließlich der NBD, vermittelt werden (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Darüber hinaus kann die indirekte Rekrutierung von RAG1 an Chromatin durch seine Interaktion mit RAG2 erfolgen, obwohl letzteres nicht vollständig für die RAG1-Bindungsmuster verantwortlich sein kann, die in Abwesenheit von RAG2 teilweise beibehalten werden, wenn auch mit verminderter Intensität (Teng et al., 2015).
Die genomische Reichweite von RAG1-Bindungsstellen, obwohl breiter als vorhergesagt, erweitert sich sogar noch weiter in Abwesenheit von Nicht-Kern-Domänen von entweder RAG1 oder RAG2. In Abwesenheit der C-terminalen Region von RAG2 (die die PHD einschließt) diffundiert RAG1 in Richtung von Stellen mit geringerer H3K4me3-Dichte, anstatt sich auf die aktivsten TSSs zu konzentrieren (Teng et al., 2015). Eine Möglichkeit ist, dass dies aus einer Demaskierung zusätzlicher unspezifischer DNA-Bindungsaktivitäten von RAG1 resultiert, da die autoinhibitorische Domäne, die in der C-terminalen Region von RAG2 liegt, fehlt (Lu et al., 2015). Eine andere Möglichkeit ist, dass der RAG-Komplex in Abwesenheit der RAG2-PHD-Domäne weniger geneigt ist, sich in Regionen mit hohem H3K4me3-Gehalt anzusiedeln. Ebenfalls relevant für das breitere RAG1-Bindungsmuster könnte die Tatsache sein, dass die Deletion der C-terminalen Region von RAG2 zu einer Hochregulierung der RAG1-Proteinspiegel führt (Teng et al., 2015). Kern-RAG1 bindet auch viel häufiger als RAG1 in voller Länge und zeigt interessanterweise eine erhöhte Bindungsintensität an vielen Nicht-Antigenrezeptorstellen, aber eine geringere Intensität am Tcra-Locus im Vergleich zu RAG1 in voller Länge (Teng et al., 2015). Dies könnte auf Veränderungen der intrinsischen DNA-Bindungseigenschaften des verkürzten RAG1-Proteins oder auf das Fehlen von Aktivitäten zurückzuführen sein, die in den Nicht-Kern-Termini von RAG1 kodiert sind (wie die RING-vermittelte Histon-Ubiquitylierung oder die C-Terminus-vermittelte Autoinhibition). Von Bedeutung könnte auch die oben erwähnte Tatsache sein, dass Core-RAG1 in wesentlich höheren Mengen exprimiert wird als RAG1 in voller Länge.
Die RAG-Rekombinase toleriert Sequenzvariationen nicht nur in ihren Substraten, insbesondere im RSS-Spacer, sondern auch im Heptamer und Nonamer (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Selbst die RAG1-Nonamer-Interaktion, die durch die NBD vermittelt wird, beruht auf relativ wenigen sequenzspezifischen Kontakten (Yin et al., 2009). Die RSS, die Antigenrezeptorgene bevölkern, sind in ihrem Sequenzinhalt vielfältig (und weichen manchmal erheblich von den Konsens-Heptamer- und Nonamer-Motiven ab), und die Substraterkennung durch RAG muss ausreichend flexibel sein, um eine maximale Repertoirevielfalt zu ermöglichen. Außerhalb der Antigenrezeptorgene zeigen die RAG1-Bindungsstellen keine kumulative Präferenz für eine bestimmte Sequenzsignatur (Teng et al., 2015).
Die flexible Substraterkennung durch RAG schafft jedoch ein Problem für den Rest des Genoms. Die relativ minimalen Sequenzanforderungen für eine funktionelle RSS (zumindest nach den Regeln, die wir derzeit verstehen) ermöglichen ein relativ häufiges Auftreten von cRSSs in Wirbeltiergenomen (Lewis et al., 1997). Die Gefahr von zufälligen cRSSs wird durch ihre Beteiligung an RAG-abhängigen genetischen Umlagerungen deutlich, die zur Lymphomagenese beitragen (Larmonie et al., 2013). Da der Großteil der RAG1-Bindung im gesamten Genom durch unspezifische Rekrutierung an DNA oder zugängliches Chromatin gesteuert wird, erscheint es biologisch sinnvoll, die Verfügbarkeit starker cRSSs in der Nähe von RAG1-Bindungsstellen zu begrenzen und so das Potenzial für Off-Target-RAG-Aktivität zu minimieren. In der Tat sind RAG1-Bindungsstellen in Maus- und menschlichen Lymphozyten bevorzugt von cRSSs dezimiert (Teng et al., 2015), und wir vermuten, dass dies aufgrund von Selektionsdruck durch genetische Umlagerungen, die außerhalb der Antigenrezeptorgene stattfinden, zustande gekommen ist. Somit ist das Repertoire der RAG1-assoziierten TSSs während der V(D)J-Rekombination vor RAG-Aktivität geschützt. Wir spekulieren, dass die seltenen cRSSs, die ihre Aktivität beibehalten und weiterhin seltene ektopische Umlagerungen vermitteln, aufgrund ihrer Überlappung mit regulatorischen oder funktionellen Sequenzen in ihren Wirtsloci im Genom beibehalten wurden oder einfach keine ausreichend starken negativen Auswirkungen hatten, um dagegen selektiert zu werden.