Nekrotrophe Lebensweise von Rhizoctonia solani AG3-PT während der Interaktion mit seiner Wirtspflanze Kartoffel durch Transkriptomanalyse

Transkriptomanalyse

Die interspezifische Interaktion zwischen R. solani AG3-PT Isolat Ben3 mit der mittelresistenten Kartoffelsorte ‚Arkula‘ wurde auf Transkriptomebene mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Um Faktoren zu finden, die für die Etablierung der Interaktion und das weitere Fortschreiten der Interaktion wichtig sind, wurden drei verschiedene Probenahmen verwendet: reines Myzel von R. solani AG3-PT Isolat Ben3, das kultiviert wurde, ohne von einer wachsenden Kartoffelpflanze angezogen zu werden (Ben3); Kartoffelsprossen bei 3 dpi der Knollen mit R. solani (früh) und 8 dpi (spät). An beiden Probenahmeterminen von R. solani in Wechselwirkung mit dem Kartoffelspross wurden alle entstehenden Sprossen geerntet und für die Analyse verwendet. Nekrotische Läsionen an den Sprossen werden erstmals bei 8 dpi sichtbar. Anschließend wurden RNA-Extraktion, RNA-Sequenzierung (RNAseq) und Mapping der Reads auf das Genom des Isolats Ben334 durchgeführt, um die Werte für Reads per Kilobase per Million Mapped Reads (RPKM) zu berechnen. Im Allgemeinen wurden bei den geimpften Proben zwischen 1 und 23 % jedes Datensatzes auf das Ben3-Entwurfsgenom gemappt. Bei den Kontrollproben konnten zwischen 70 und 75 % dieser Datensätze auf das Ben3-Genom abgebildet werden.

In allen drei Proben konnte eine vergleichbare Anzahl von Genen als exprimiert nachgewiesen werden (Tabelle 1). Im reinen Mycel wurden 11.206 der 12.567 identifizierten Gene auf dem Genom des R. solani AG3-PT Isolats Ben3 exprimiert, während Reads auf 10.181 und 9.939 Genen bei 3 dpi bzw. 8 dpi kartiert werden konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen Transkriptomen dieses Experiments 11.287 der 12.567 identifizierten Gene auf dem R. solani AG3-PT Isolat Ben3 Genom in jeder der analysierten Proben exprimiert wurden.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, unterschieden sich die Mengen der insgesamt kartierten Reads erheblich. Dies ist der Tatsache geschuldet, dass bei der Ben3-Probenahme das Transkriptom des reinen Myzels von R. solani AG3-PT Isolat Ben3 sequenziert wurde, während bei den frühen und späten Probenahmen (3 und 8 dpi) ein dualer RNAseq-Ansatz verwendet wurde, um auf die Transkriptome beider interagierender Organismen gleichzeitig zuzugreifen30. Da die Bibliotheksgrößen und die Menge der aus jeder Bibliothek produzierten Sequenzen vergleichbar waren, konnten bei der Ben3-Probeentnahme fast alle Reads dem Genom des Isolats Ben3 zugeordnet werden. Bei den dualen RNAseq-Ansätzen der Probenahmen bei 3 und 8 dpi konnte nur ein Bruchteil der produzierten Reads dem Ben3-Genom zugeordnet werden, während die anderen hauptsächlich dem Kartoffelgenom zugeordnet wurden. Aufgrund dieser unterschiedlichen Mengen an insgesamt auf das Ben3-Genom des R. solani AG3-PT-Isolats gemappten Reads pro Probenahme ist Folgendes zu berücksichtigen: (1) Gene mit niedrigem RPKM-Wert nur in Ben3 werden nicht notwendigerweise nicht exprimiert, wenn der Pilz die Pflanze angreift, sondern könnten nur der Bibliotheksgröße geschuldet sein; (2) Gene, die in allen drei Probenahmen exprimiert werden, könnten als allgemein exprimiert eingestuft werden; (3) Gene, die nur in den viel kleineren Bibliotheken der Probenahmen von 3 und 8 dpi exprimiert werden, können als interaktionsspezifisch angenommen werden.

Die zusammengefassten Kartierungsergebnisse (Tabelle 1) deuteten bereits darauf hin, dass es viele Gene geben muss, die in allen drei Probenahmen gemeinsam exprimiert werden. Daher wurde ein Venn-Diagramm erstellt, um die drei Probenahmen zu vergleichen und die berechnete Anzahl der gemeinsamen Gene gegenüber der Anzahl der Gene, die die einzelnen Probenahmen unterscheiden, zu visualisieren (Abb. 1). Es wurde festgestellt, dass mehr als 9.000 Gene in allen drei Proben exprimiert werden, während 871 ausschließlich im Myzel ohne Pflanzenkontakt transkribiert wurden. Die Expression von 29 Genen wurde in den Proben mit 3 und 8 dpi gemeinsam festgestellt, wobei es sich um Gene handelt, die nur in Gegenwart der lebenden Kartoffelpflanze exprimiert werden. Darüber hinaus wurden bei 3 dpi 27 Gene exklusiv exprimiert, und Sequenzlesungen, die einer kleinen Gruppe von 21 Genen zugeordnet wurden, waren bei 8 dpi exklusiv nachweisbar. Listen dieser Gene zusammen mit ihren jeweiligen RPKM-Werten und Beschreibungen sind in den ergänzenden Tabellen 1 – 4 enthalten.

Von den 29 Genen, die in Gegenwart der lebenden Kartoffelpflanze häufig exprimiert wurden, kodieren vier Gene für Proteine, die am Abbau der Pflanzenzellwand beteiligt sind. Dies entspricht der Virulenzstrategie eines nekrotrophen Erregers, der zellwandabbauende Enzyme absondert, um eine Nekrose der Wirtszelle und den Austritt von Nährstoffen auszulösen21. Darüber hinaus unterstützt ein Gen, das für ein Protein kodiert, das am Proteinabbau beteiligt ist, diese Angriffsstrategie. Darüber hinaus sind zwei Gene, die für Proteine mit DNA-Bindungsdomänen und mutmaßlicher Funktion bei der Transkriptionsregulierung kodieren, ebenfalls in dieser Liste enthalten und spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Transkriptionsregulierung des Befalls (z. B. Ben3g4553, siehe Tabelle 2). Die meisten der 27 Gene, die ausschließlich bei 3 dpi exprimiert werden, kodieren für hypothetische Proteine, denen keine putative Funktion zugeordnet werden kann. Von den 21 Genen, die ausschließlich in späteren Stadien der Interaktion (8 dpi) exprimiert wurden, kodieren acht Gene für Proteine, die am Abbau der pflanzlichen Zellwand beteiligt sind, und zwei Gene kodieren für Proteasen. Dies zeigt erneut die typische Strategie eines nekrotrophen Erregers.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine erste Untersuchung der Transkriptomdaten der drei Probenahmen deutliche und begründete Unterschiede ergab, was das Potenzial dieser Studie zeigt, Faktoren zu finden, die für die Etablierung der Interaktion zwischen R. solani AG3-PT Isolat Ben 3 mit einer anfälligen Kartoffelsorte und für den weiteren Verlauf der Interaktion wichtig sind.

Die häufigsten R. solani AG3-PT Transkripte in den drei Proben

Die interspezifische Interaktion zwischen R. solani AG3-PT Isolat Ben 3 und der mittelresistenten Kartoffelsorte ‚Arkula‘ wurde zunächst durch die Untersuchung der häufigsten Transkripte in den drei verschiedenen Proben bewertet. In wachsendem Myzel, das in Flüssigkultur kultiviert wurde, wurden Transkripte von 11 206 Genen des Isolats Ben3-Genoms gefunden. Insgesamt wurden 698 Transkripte dieser Gene mit medianen RPKM-Werten von 100 und mehr nachgewiesen, 37 mit medianen RPKM-Werten von mehr als 1.000. In der frühen Interaktionsphase (3 dpi) der Knollensprossen mit dem Erreger wurden Transkripte von 10.181 Genen nachgewiesen, von denen 729 einen mittleren RPKM-Wert von 100 und mehr aufwiesen, 25 einen mittleren RPKM-Wert von mehr als 1.000. Bei R. solani AG3-PT wurden 9.939 Gene transkribiert, von denen 742 im Median RPKM-Werte von 100 und höher aufwiesen, 26 im Median RPKM-Werte von mehr als 1.000 (siehe ergänzende Tabellen 5-7). Insgesamt wurden 9.679 Gene des Isolat-Ben3-Genoms in allen drei Probenahmen exprimiert, darunter die am häufigsten vorkommenden Transkripte in jeder der analysierten Einzelproben. Fünf dieser am stärksten exprimierten Gene (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 und Ben3g675) kodieren für R. solani-spezifische hypothetische Proteine mit unbekannten Funktionen. Es wird daher nicht erwartet, dass diese Proteine während der Interaktion mit der Pflanze eine spezifische Rolle spielen; vielmehr könnten sie für das allgemeine Wachstum und den zellulären Stoffwechsel wichtig sein. Zu den am häufigsten vorkommenden Transkripten in den einzelnen Proben gehören auch mehrere Proteine, die Lektindomänen enthalten (Ben3g9146, Ben3g9350 und Ben3g8869). Eine Reihe solcher Proteine, die eine Beta-Trefoil-Lektin-Domäne vom Ricin-Typ enthalten, wurden bereits früher als am häufigsten im R. solani AG1-IB-Isolat 7/3/14 während der Interaktion mit seiner Wirtspflanze Salat30 berichtet. Während die spezifische Rolle dieser Lektindomänen-Proteine unklar ist, wurde vorgeschlagen, dass die Lektine von R. solani eine Funktion als Speicherprotein innerhalb des Myzels haben könnten37. Darüber hinaus wurden zwei Gene, die für Proteine mit Thuringiensis-Toxin-Domäne kodieren (Ben3g8806 und Ben3g11931), in allen drei untersuchten Proben ebenfalls stark transkribiert. Bei den Toxinen von Bacillus thuringiensis handelt es sich um bakterielle Proteine, die für ihre biozide Wirkung gegen Insekten38 bekannt sind, aber auch gegen eine Reihe weiterer Organismen eingesetzt werden39. Die starke Expression solcher Toxin-Domänen-Homologe in R. solani deutet darauf hin, dass diese Toxine für das R. solani AG3-PT-Isolat Ben3 von allgemeiner Bedeutung sein könnten und nicht nur eine spezifische Rolle in der Pilz-Pflanzen-Interaktion spielen. Ein Gen, das für ein septales Porenkappenprotein (Ben3g7115) kodiert, gehörte ebenfalls zu den am häufigsten vorkommenden Transkripten in allen drei Probenahmen, was auf seinen Beitrag zur Hyphenhomöostase bei Basidiomycetenpilzen hinweist40. Ein Transkript, das dem Septumporenprotein (RSOLAG1IB_6054) ähnelt, war ebenfalls sehr häufig in den Transkripten des R. solani AG1-IB-Isolats 7/3/14, die in der symptomlosen Zone der Interaktion mit Salat gefunden wurden30. Dieses für R. solani spezifische Protein ist Teil des Pfropfenmaterials, das die Perforationen innerhalb der septalen Porenkappe von Hyphenzellen verschließt und den Transport von Zytoplasmaflüssigkeiten zwischen benachbarten Zellen verhindert. Darüber hinaus gehörte ein Gen, das für ein Hämopexin-Domänenprotein (Ben3g6614) kodiert, zu den am stärksten exprimierten Genen in allen drei Probenahmen. Diese Domäne steht für zinkabhängige Metalloproteinasen, die bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der homöostatischen Regulierung des extrazellulären Milieus spielen41, deren biologische Funktionen aber auch über den Abbau der extrazellulären Matrix hinausgehen können42. Da alle diese Proteine in R. solani AG3-PT mit und ohne Kontakt zur Wirtspflanze in großer Menge vorkamen, könnten sie für das allgemeine Wachstum und den Stoffwechsel wichtig sein, scheinen aber keine spezifische Bedeutung für die Interaktion des Pilzes mit der Pflanze zu haben.

Die Interaktion zwischen R. solani AG3-PT und Kartoffel

Um Elemente zu finden, die für die Unterstützung der Interaktion von R. solani AG3-PT Isolat Ben3 mit dem Kartoffelspross relevant sind, wurde eine differenzielle Genexpression durchgeführt, die in die ReadXplorer-Plattform (v2.2)43 integriert ist. Dieser paarweise Vergleich der Transkriptome des reinen Myzels von Isolat Ben3 mit den Transkriptomen von entweder 3 dpi oder 8 dpi der Interaktion mit Kartoffelsprossen wurde mit dem DESeq2-Programm durchgeführt. Gene wurden als differenziell exprimiert eingestuft, wenn der bereinigte P-Wert weniger als 0,05 betrug und die minimale Fold-Change mindestens 2 betrug. Anhand dieser Kriterien konnten 592 Gene als differenziell induziert bei 3 dpi eingestuft werden (Summe von 242 Genen, die ausschließlich früh induziert wurden, und 350 Genen, die bei 3 dpi und auch bei 8 dpi induziert wurden; early up), während 520 Gene bei 3 dpi differenziell reduziert sind (Summe von 412 Genen, die ausschließlich früh reduziert wurden, und 108 Genen, die bei 3 dpi und auch bei 8 dpi reduziert wurden; early down). Bei 8 dpi wurden 688 Transkripte als unterschiedlich induziert (Summe von 338 Genen, die ausschließlich spät induziert wurden, und 350 Genen, die bei 8 dpi und auch bei 3 dpi induziert wurden; late up) und 233 als unterschiedlich reduziert (Summe von 125 Genen, die ausschließlich spät reduziert wurden, und 108 Genen, die bei 8 dpi und auch bei 3 dpi reduziert wurden; late down) gefunden. Es wurden Venn-Diagramme erstellt, um die zu beiden Zeitpunkten während der Interaktion unterschiedlich hochregulierten und herunterregulierten Gene zu vergleichen und zu visualisieren (Abb. 2). Listen dieser Gene zusammen mit den jeweiligen Werten der Fold Change sind in den ergänzenden Tabellen 8-9 aufgeführt.

Die mit dieser DESeq2-Analyse gefundenen Expressionsunterschiede wurden in Experimenten mit qRT-PCR validiert. Daher muss ein geeignetes Kontrollgen mit unveränderlichem Expressionsmuster festgelegt werden. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Ben3g7151, GAPDH), Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 (EUC63156, UBC), Ubiquitin-Protein-Ligase E3 (Ben3g494, UBI), Elongationsfaktor 2 (Ben3g3364, EF-2) und Beta-Tubulin-Gene (Ben3g4099; TUB1) und (Ben3g5288, TUB2) getestet, und das Beta-Tubulin-Gen Ben3g5288 (TUB2) erwies sich in unseren Experimenten als die am besten geeignete Referenz. Die relativen Transkriptionsniveaus von drei Kandidatengenen mit unterschiedlichen Expressionsmustern wurden auf der Grundlage der Expression dieser invarianten Kontrolle normalisiert. Die ΔΔCq-Werte wurden berechnet und mit der entsprechenden DESeq2-Analyse verglichen (Tabelle 2).

Für alle drei Kandidatengene mit sehr unterschiedlichen Expressionsmustern stimmten die berechneten ΔΔCq-Werte mit den jeweiligen log2fachen Veränderungswerten überein, die in der DESeq2-Analyse berechnet wurden, was die Validierung der Expressionsunterschiede belegt.

Zusätzlich wurden Gen-Ontologie (GO)-Annotationen durchgeführt, um den einzelnen Genen entsprechende Funktionen zuzuordnen. In der weiteren Analyse wurde ein besonderer Fokus auf signifikant induzierte Gene gelegt, um bevorzugt molekulare Kandidaten zu erfassen, die für die Initiierung und Etablierung der Interaktion mit der Pflanze wichtig sein könnten.

Differenziell exprimierte Gene (DEGs) im Isolat Ben3 bei 3 dpi von Kartoffelsprossen

Differenziell induzierte Gene im Isolat Ben3 bei der Interaktion mit Kartoffelsprossen bei 3 dpi im Vergleich zum reinen Myzel des Isolats wurden ausgewählt, wobei Funktionen bei der Initiierung und Unterstützung des Interaktionsprozesses mit den Kartoffelsprossen angenommen wurden. Die vermuteten Funktionen der einzelnen Genprodukte und ihre Verteilung auf die gemeinsamen GO-Aspekte für den biologischen Prozess (BP), die molekulare Funktion (MF) und die zelluläre Komponente (CC) sind in Abb. 3 dargestellt.

Bei 3 dpi werden die differenziell induzierten Gene hauptsächlich den Stoffwechselprozessen von Kohlenhydraten und zellulären Stickstoffverbindungen sowie dem Transport zugeordnet. Fast 10 % (50 Gene) der unterschiedlich hochregulierten Gene kodieren für verschiedene Peptidase-Aktivitäten (z. B. Ben3g2070, siehe Tabelle 2), während 53 Gene für zellwandabbauende Enzyme kodieren, darunter mehrere verschiedene Hydrolasen, die auf Glykosylbindungen einwirken, sowie Pektatlyasen (z. B. Ben3g3530, siehe Tabelle 2) oder Xylanasen. Um diese zellwandabbauenden Enzyme weiter zu spezifizieren, wurden alle DEGs auch gemäß der Datenbank Carbohydrate Active enZyme (CAZy) annotiert (ergänzende Tabelle 11). Die Sekretion eines großen Arsenals hydrolytischer Enzyme wie Proteasen und zellwandabbauender Enzyme im Verlauf der Interaktion44,45 ist für nekrotrophe pilzliche Pflanzenpathogene wie R. solani erforderlich, um durch den Abbau struktureller Protein- und Kohlenhydratkomponenten der Pflanzenzellwände eine Zellnekrose zu induzieren und den Austritt von Nährstoffen zu verursachen9,30,46,47. Es wird daher angenommen, dass die induzierten zellwandabbauenden Enzyme und mehrere der induzierten Peptidasen die Interaktion von R. solani AG3-PT mit dem Gewebe des Kartoffelsprosses unterstützen. Sekretierte Peptidasen wurden jedoch auch ausgiebig auf ihre Rolle als Effektoren von gramnegativen Bakterien48 und auch Pilzen47,49 untersucht. Pathogene Effektoren werden in der Regel als Virulenzfaktoren in die Wirtszellen eingebracht, um die basalen Abwehrreaktionen zu unterdrücken und ein geeignetes Umfeld für die Vermehrung des Pathogens zu schaffen50,51,52. Somit ist die posttranslationale Modifikation von Wirtsproteinen durch proteolytische Verarbeitung ein weit verbreiteter Mechanismus zur Regulierung der pflanzlichen Abwehrreaktion. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand könnte man annehmen, dass eine oder mehrere dieser induzierten Proteasen eine mutmaßliche Rolle als Effektoren spielen, die die Interaktion von R. solani AG3-PT auf dem Kartoffelwirt unterstützen. Es sind jedoch weitere funktionelle Analysen der einzelnen Proteasen erforderlich, um ihre funktionelle Rolle in der Pathogen-Wirt-Interaktion eindeutig zuzuordnen.

Eine weitere große Gruppe, die sich aus 100 Mitgliedern von unterschiedlich hochregulierten Genen der Interaktion bei 3 dpi zusammensetzt, wird als Kodierung für hypothetische Proteine beschrieben. Die meisten dieser Gene sind R. solani-spezifisch und Homologe konnten in den anderen fünf annotierten Genomen von R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8 und R. solani AG1-IA und AG1-IB gefunden werden. Unsere Analyse der differentiellen Genexpression lässt vermuten, dass einige dieser Gene an der Unterstützung der Interaktion von R. solani AG3-PT auf dem Kartoffelspross beteiligt sind. Es ist bereits bekannt, dass sekretierte Effektoren von Pilzpathogenen die Wirtsimmunität mit verschiedenen Strategien angreifen, z. B. durch Hydrolyse eines Salicylsäurevorläufers53 oder durch Bindung an Transkriptionsfaktoren, wodurch deren Aktivität gehemmt wird54. Weitere Analysen sind erforderlich, um die mutmaßlichen Funktionen der bisher hypothetischen Proteine für ihre verschiedenen möglichen Rollen bei der Interaktion von R. solani AG3-PT mit der Kartoffel aufzudecken.

Interessanterweise ist das am stärksten differenziell erhöhte Gen (Ben3g6247) homolog zu Proteinen der Lipid-translozierenden Exporter (LTE)-Familie, wie RTA1 aus Saccharomyces. Das RTA1-Protein enthält sieben potenziell membranüberspannende Segmente55 und wird als integrales Membranprotein mit einer Funktion bei der Zellresistenz gegen Xenobiotika56 beschrieben. Andere Gene der LTE-Familie können für Transporter oder Sensoren kodieren, die die Ausscheidung von Biosynthesezwischenprodukten entweder direkt oder indirekt erleichtern56. Diese mutmaßlichen Funktionen der Proteine der LTE-Familie machen das Gen Ben3g6247 zu einem bevorzugten Kandidaten, der an der Sekretion von Komponenten beteiligt ist, die für den Pathogenangriff wichtig sind.

Die frühe Phase der nekrotrophen Interaktion ist mit dem Zelltod des Pflanzenwirts und der Produktion verschiedener Sekundärmetaboliten sowie der Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies verbunden21. Es wurde gezeigt, dass antioxidative Prozesse und die entsprechende Genexpression mit nekrotischem Gewebe in verschiedenen Pathosystemen von R. solani korreliert sind (Kartoffelkeimling – R. solani AG3; Sojabohnenhypokotyl – R. solani AG4 und Sojabohnenblätter – R. solani AG1-IA)27. In der frühen Phase der Interaktion des Kartoffelwirts mit dem Isolat Ben3 (3 dpi) konnte auf der Transkriptionsebene kein deutlicher Hinweis auf eine Induktion antioxidativer Prozesse in den Hyphen des Pathogens beobachtet werden, da es keinen starken Anstieg der Genexpression der Glutathion-S-Transferase oder eine Hochregulierung anderer Gene gab, die bekanntermaßen an der Abfangung reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind. Daher könnte man annehmen, dass in unserem System zur Besiedlung des Kartoffelsprosses mit R. solani AG3-PT die Gewebeanalyse bei 3 dpi einem frühen Stadium der Interaktion mit dem Pflanzenpathogen ähnelt, möglicherweise vor der Infektion des Sprossgewebes. Zu diesem Zeitpunkt wurden keine sichtbaren Symptome beobachtet.

Differenziell exprimierte Gene im Isolat Ben3 bei 8 dpi von Kartoffelsprossen

Um Transkripte zu finden, die in einem fortgeschrittenen Stadium der Interaktion wichtig sind, wurden differenziell induzierte Gene zwischen reinem Myzel des Isolats Ben3 und Ben3, das von Kartoffelsprossen bei 8 dpi angezogen wurde, untersucht. Die jeweiligen funktionellen Annotationen der Genprodukte und ihre Verteilung auf die gemeinsamen GO-Merkmale sind in Abb. 4 dargestellt. Bei 8 dpi sind die unterschiedlich induzierten Gene hauptsächlich an Kohlenhydrat- und makromolekularen Stoffwechselprozessen und am Transport beteiligt. In diesem späteren Stadium der Interaktion kodieren die hochregulierten 152 Gene (> 22 %) für verschiedene zellwandabbauende Enzyme (z. B. Ben3g3530, siehe Tabelle 2). Darüber hinaus wurden alle DEGs auch gemäß der Carbohydrate Active enZyme (CAZy) Datenbank annotiert (ergänzende Tabelle 11). Diese erhöhte Expression von Genen, die für hydrolytische Enzyme der Zellwand kodieren, zeigt deutlich die zunehmende pathogene Aktivität des Isolats Ben3 sowie die Bedeutung des Abbaus von Zellwandkomponenten für den Zugang zu den Nährstoffen im Verlauf der Interaktion und bestätigt damit die beschriebene Virulenzstrategie eines nekrotrophen Pathogens21,57. Diese zerstörerische Taktik ging mit einer Induktion der Expression von Genen einher, die für integrale Bestandteile von Membranen kodieren. Diese 154 meist nicht charakterisierten integralen Membranproteine und mutmaßlichen Transporter waren vermutlich an der Aufnahme von Nährstoffen und Abbauprodukten der Hydrolaseaktivitäten beteiligt. In diesem Stadium der Interaktion schien die vorherrschende Bedeutung von Genen, die für Peptidasen kodieren, abzunehmen, aber immer noch waren 33 Gene, die für Peptidasen kodieren, unterschiedlich hochreguliert (z. B. Ben3g2070, siehe Tabelle 2). Dies könnte auch darauf zurückzuführen sein, dass ganze Sprossen geerntet wurden, einschließlich der Sprossen, die bis zu 8 Tage lang mit dem Krankheitserreger interagiert haben, und der später aufkommenden Sprossen mit einer kürzeren Interaktionszeit. Im Allgemeinen zeigt sich dies auch in den 350 Genen, die bei 3 und 8 dpi unterschiedlich erhöht waren (Abb. 2).

Außerdem besteht eine weitere große Gruppe von DEGs bei 8 dpi aus 98 Genen mit unbekannter Funktion. Da diese Gene Rhizoctonia-spezifisch sind und keine Ähnlichkeit mit Sequenzen mit zugewiesenen Funktionen aufweisen, kann über ihre Rolle bei der Unterstützung der Pathogen-Pflanzen-Interaktion nur spekuliert werden. Weitere funktionelle Vergleiche dieser Gene und z.B. ihre differentielle Expression in den jeweiligen Pathosystemen könnten Hinweise auf ihre vermutete Funktion geben.

In dem hier beschriebenen Versuchssystem zur Besiedlung des Kartoffelsprosses mit R. solani AG3-PT Isolat Ben3 werden Läsionen erstmals bei 8 dpi sichtbar. In anderen Experimenten25,27 wurde gezeigt, dass die nekrotrophe Interaktion und der Zelltod im Pflanzenwirt mit der jeweiligen Genexpression in der Pflanze und im Pilz korreliert. Samsatly und Mitarbeiter27 wiesen mit Hilfe quantitativer RT-PCR nach, dass die Expression antioxidativer Gene, die für Glutathion-S-Transferase und Katalase kodieren, bei R. solani AG3 fünf Tage nach der Inokulation abgelöster Kartoffelsprossen deutlich erhöht war. Eine solch stark erhöhte Expression dieser antioxidativen Gene konnte in den hier beschriebenen Experimenten jedoch nicht festgestellt werden. Der Grund für diese Unterschiede könnte darin liegen, dass bei der Inokulation Isolate von R. solani AG3 verwendet wurden, die Unterschiede in der Pathogenität aufweisen. Ein weiterer Unterschied ist jedoch die Tatsache, dass Samsatly und Mitarbeiter27 Experimente mit abgetrennten Sprossen in einem begrenzten In-vitro-System durchführten, während unser Versuchsaufbau die Bedingungen der In-vivo-Umgebung mit wachsenden Sprossen auf kultivierten Samenknollen vollständig widerspiegelt. Weitere Untersuchungen zusammen mit der begleitenden Transkriptomanalyse im Kartoffelwirt werden schließlich das Verständnis der gegenseitigen Beziehung in der Wirt-Pathogen-Interaktion in einer Umgebung, die der natürlichen Situation ähnelt, verbessern.

Differenziell exprimierte Gene im Isolat Ben3 beim Vergleich von 3 und 8 dpi von Kartoffelsprossen

Um zwischen R. solani AG3-PT-Transkripten zu unterscheiden, die hauptsächlich zu einem frühen Zeitpunkt relevant waren, und solchen, die in fortgeschrittenen Stadien der Interaktion wichtiger wurden, wurden die differenziell exprimierten Gene zwischen 3 und 8 dpi der Interaktion ebenfalls mit DESeq2 analysiert. Unter Verwendung der oben genannten Kriterien mit bereinigten P-Werten von weniger als 0,05 und einer minimalen Fold-Change von |2| oder mehr konnten 173 Gene als differenziell reduziert exprimiert zwischen 3 und 8 dpi zugeordnet werden, während 400 Gene zu dem späteren Zeitpunkt differenziell verstärkt exprimiert sind. Vollständige Listen dieser Gene zusammen mit ihren jeweiligen baseMean-Werten und Werten der Fold Change sind in der ergänzenden Tabelle 10 aufgeführt, Listen der 20 am stärksten differenziell exprimierten Gene zwischen 3 und 8 dpi sind in den Tabellen 3 und 4 dargestellt. Während 10 der 20 am stärksten reduziert exprimierten Gene zwischen 3 und 8 dpi für Proteine kodieren, die am Proteinabbau und an der Stickstoffaufnahme und -assimilation beteiligt sind (Tabelle 3), sind die meisten der zwischen 3 und 8 dpi verstärkt exprimierten Gene am Polysaccharidabbau beteiligt, wobei der Schwerpunkt auf kupferabhängigen lytischen Polysaccharidmonooxygenasen für die Spaltung von Celluloseketten mit Oxidation verschiedener Kohlenstoffe liegt (Tabelle 4).

Es ist bekannt, dass der Stickstoff-Stoffwechsel und die Stickstoff-regulierte Genexpression in pflanzenpathogenen Pilzen von großer Bedeutung für die Etablierung der Krankheit in der Wirtspflanze ist58. Allerdings ist Nitrat im Vergleich zu Ammonium und L-Glutamin die weniger bevorzugte Stickstoffquelle im Hinblick auf die Nährstoffverwertung bei Pilzen, zumindest während der Infektion der Blätter59. In Pilzen wird diese bevorzugte Nährstoffverwertung über die Repression von Stickstoffmetaboliten reguliert und sorgt für die Transkription von Genen, die für aktive Ammonium- und Harnstoffpermeasen kodieren. Neben der starken transienten Expression von Genen, die für Ammonium und stickstoffhaltige Verbindungen transportierende Permeasen (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 und Ben3g7775) kodieren, zeigte das R. solani AG3-PT-Isolat Ben3 in der frühen Interaktionsphase bei 3 dpi auch eine hohe Induktion und Expression von Genen, die an der Nitrataufnahme und -assimilation beteiligt sind (Ben3g6360, Ben3g6359 und Ben3g6361). Ob es sich hierbei um eine Besonderheit des Isolats Ben3 oder um ein Merkmal bodenbürtiger pflanzenpathogener Pilze handelt, müsste weiter untersucht werden.

Die Mehrzahl der Gene, deren Expression zwischen 3 und 8 dpi erhöht war, sind am Zellwandabbau beteiligt und kodieren für Hydrolasen, die auf Glykosylbindungen einwirken, und Pektatlyasen. Dies war zu erwarten und zeigt erneut die zunehmende Bedeutung des Abbaus von Zellwandkomponenten für die Virulenzstrategie eines nekrotrophen Pathogens21.