Abstract
5-5′‘-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB oder Ellman-Reagenz; Ref. 1) reagiert mit der freien Sulfhydryl-Seitenkette von Cystein und bildet eine S-S-Bindung zwischen dem Protein und einem Thionitrobenzoesäurerest (TNB). Die Modifikation ist im Allgemeinen schnell und selektiv. Der Hauptvorteil von DTNB gegenüber alternativen Reagenzien (z. B. N-Ethylmaleimid oder Iodacetamid) liegt in der Selektivität dieses Reagenzes und in der Möglichkeit, den Verlauf der Reaktion spektrophotometrisch zu verfolgen. Die Reaktion wird in der Regel bei pH 7,0-8,0 durchgeführt, und die Modifikation ist unter oxidativen Bedingungen stabil. Die TNB-Gruppe kann aus dem modifizierten Protein durch Behandlung mit Reagenzien freigesetzt werden, die routinemäßig zur Reduktion von S-S-Bindungen verwendet werden, z. B. Mercaptoethanol, oder durch Kaliumcyanid (2) (siehe Anmerkung 1). Darüber hinaus können die oft stark ausgeprägten Unterschiede in der Reaktivität verschiedener Cystein-Seitenketten im selben Protein oder sogar in der aktiven Stelle und die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Thiol-modifizierenden Reagenzien ausgenutzt werden, um Cystein-Seitenketten in Proteinen in Gegenwart anderer, reaktiverer Cystein-Reste selektiv zu modifizieren (3).