Mikrobiologie & Experimentieren

In dieser Studie wurde die Isolierung und Charakterisierung von Bakterienstämmen aus der Stadtverwaltung von Barrackpore und der Mülldeponie von Dhapa vorgenommen. Das Bakterienwachstum hängt von verschiedenen physikalisch-chemischen Bedingungen ab, wie Medien, pH-Wert, Temperatur, Inkubationszeit, Kohlenstoffquelle usw. Daher sollten die verschiedenen Bedingungen, unter denen Bakterien in ihrem natürlichen Lebensraum wachsen, untersucht werden, bevor eine massive Vermehrung zur Verwendung als Zersetzer erfolgt. Daher wurden die folgenden Parameter berücksichtigt:

Physikalische und chemische Eigenschaften des Hausmülls

Bakterien können in einem breiten Spektrum von Feuchtigkeitsgraden wachsen. In dieser Studie wurde festgestellt, dass der Feuchtigkeitsgehalt der gesammelten Proben aus der Stadtverwaltung von Barrackpore und der Mülldeponie von Dhapa bei 65,32 % bzw. 66,45 % lag. Die Bakterienpopulation verschiedener Böden ist eng mit ihrem Feuchtigkeitsgehalt korreliert. Die höchste Bakteriendichte findet sich in Regionen mit relativ hohem Feuchtigkeitsgehalt, und das Optimum für die Aktivitäten aerober Bakterien liegt oft bei 50-75 % der Feuchtigkeitsspeicherkapazität des Bodens.1 Die Gattungen Pseudomonas, Achromobacter und Bacillus sind in den meisten aeroben Böden zu finden; wo die Bedingungen anaerob und feucht sind, kommt Clostridium vor. Actinomyceten zeigten unter solchen Bedingungen eine ähnliche quantitative Zunahme.15

In dieser Studie wurde der pH-Wert der beiden ausgewählten Medien (BCDA und NA) für die Kultivierung von Bakterienstämmen optimiert. Der pH-Wert der entnommenen Probe betrug in beiden Proben 7,79. Der pH-Wert ist ein Schlüsselfaktor für das Wachstum von Bakterien in künstlichen Medien. Die Optimierung des pH-Wertes wurde in zwei ausgewählten Medien durchgeführt, nämlich Nährstoffagar (NA) und Basischer Czapek-Dox-Agar (BCDA). NA und BCDA mit einem pH-Wert von 7,2 und 7,6 erwiesen sich als geeignet für das maximale Wachstum der Bakterienstämme. Aus den Ergebnissen ging hervor, dass der pH-Wert der Probe bei etwa 7,79 lag. Möglicherweise aus diesem Grund wuchsen diese Stämme auch unter In-vitro-Bedingungen bei einem pH-Wert von 7-8 in BCDA und NA gut. Bakterien können eine Bodenreaktion zwischen pH-Werten von 4 und 10 tolerieren, aber der günstigste pH-Wert für die meisten ist nur eine alkalische Seite der Neutralität. Bakterien wie Thiobacillus thiooxidans und Acetobacter sp. sind in der Lage, bei sehr niedrigen pH-Werten zwischen pH 0 und 2 zu wachsen, und einige Bacillus sp. können bei pH 11 wachsen.15 Das optimale Wachstum von Thermoactinomyceten findet bei einem pH-Wert von 8 oder 9 statt und wird durch Reaktionen um pH 516 stark beeinträchtigt. Vibrio, Streptococcus faecalis und Escherichia coli tolerieren ebenfalls eine alkalische Reaktion (pH 8-9).16

Zunächst wurde der NPK-Gehalt der Probe untersucht. Der Gehalt an organischer Substanz betrug 27,84 % (Gemeinde Barrackpore) und 29,32 % (Dhapa), der Stickstoffgehalt in % 0,165 (Gemeinde Barrackpore) und 0,179 (Dhapa), der Phosphorgehalt in % 0,502 (Gemeinde Barrackpore) und 0,545 (Dhapa) und der Kaliumgehalt in % 18,29 (Gemeinde Barrackpore) und 19,21 (Dhapa). All diese Analysen vermittelten ein klares Verständnis der nativen Umgebung der Bakterien und waren somit die entscheidenden Faktoren bei der Isolierung und Kultivierung der Stämme.

Kulturelle Eigenschaften der Bakterienisolate

In unserer Studie wurden BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 und C3 – diese 9 Bakterienstämme in Kulturmedien isoliert. Czapek Dox Agar und Nutrient Agar wurden ausgewählt, um die am besten geeigneten Medien für ein massives Wachstum der isolierten Stämme zu bestimmen. Czapek Dox Agar (BCDA) war für ein massives Wachstum von BM3, D1, C2 geeignet und Nutrient Agar (NA) Medium war für ein massives Wachstum von BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 geeignet. Es wurde festgestellt, dass Hefeextrakt-Xylan-haltige Medien für ein maximales Bakterienwachstum geeignet waren, aber Pseudomonas sp., Bacillus spp. und Aeromonas sp. wuchsen gut in Nährstoffagar-Medien. Zur Charakterisierung der ausgewählten Stämme wurden visuelle und mikroskopische Beobachtungen durchgeführt. Einzelheiten zu den Koloniemerkmalen der Bakterien sind vermerkt (Tabelle 1). Die Gram-Färbung ist eine alte und zuverlässige Methode zur Beobachtung der Bakterien. Gram-negative Bakterien wurden durch Alkohol entfärbt, wobei sie die violette Farbe von Kristallviolett verloren. Gram-positive Bakterien entfärbten sich nicht und blieben violett.

In der vorliegenden Untersuchung, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 und C3 – diese 9 Bakterienstämme wurden isoliert und die mikrobiologische Charakterisierung wurde durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass es sich bei BM1, BM3 und D1 um grampositive Bazillen, bei BM2 um grampositive kurze Bazillen, bei D2 um grampositive Diplobazillen, bei D3 und C2 um gramnegative Bazillen, bei D4 um gramnegative kurze Bazillen und bei C3 um grampositive Kokken handelt. Für die 9 Isolate wurden auch verschiedene biochemische Tests durchgeführt, um ihre biochemischen Eigenschaften zu ermitteln. Einzelheiten zu den biochemischen Merkmalen der Bakterien sind in (Tabelle 2) aufgeführt.

Die obigen Ergebnisse vermittelten einen Eindruck von der Morphologie, den Kolonieeigenschaften und der biochemischen Beschaffenheit der isolierten Stämme, was in Zukunft bei der Identifizierung und Charakterisierung der isolierten Bakterienstämme helfen würde.

Optimierung der Wachstumsbedingungen

In der vorliegenden Untersuchung wurde das Wachstum der isolierten Stämme in verschiedenen Wachstumsmedien wie NA, ACDA und BCDA beobachtet. Es zeigte sich, dass der basische Czapek-Dox-Agar (BCDA) für ein massives Wachstum von BM3, D1, C2 und das Nährstoffagar (NA) Medium für ein massives Wachstum von BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 geeignet war.

In diesem Experiment wurden die Bakterienkulturen von 9 Stämmen bei verschiedenen Temperaturen wie 25, 29, 34, 37 und 40 °C bebrütet. Das optimale Wachstum aller Stämme wurde bei 37 °C festgestellt. Der optimale Temperaturbereich für Bakterien liegt bei etwa 25-36 °C. Eine große Anzahl von Bakterien kann bei einer Temperatur von 10-4 °C recht gut wachsen.6 Sultana17 stellte fest, dass 33± 4 °C ideal für das Wachstum von Bakterien sind.17 Bestimmte Bakterien entwickeln sich am stärksten bei Temperaturen unter 20 °C. Thermophile wachsen gut bei Temperaturen von 45-65 °C, und einige Thermophile sind nicht in der Lage, sich unter 40 °C zu vermehren.1

Die in dieser Studie gewonnenen Stämme wurden für verschiedene Inkubationszeiten (6, 12, 24, 36, 48 und 72 Stunden) bebrütet. Eine Inkubationszeit von 24 Stunden war für BM1, BM2, D2, D3, D4 und C3 geeignet, während BM3, D1 und C2 mit einer Inkubationszeit von 36 Stunden als geeignet befunden wurden. Coliforme Bakterien wachsen bei einer Inkubationszeit von 24± 2 Stunden und bei 32°C, und sie zeigen ein gutes Wachstum bei 37°C für 48 Stunden Inkubation. Bei der visuellen Beobachtung wurde festgestellt, dass nach 24 Stunden Inkubation die Farbe von BM2 hellorange, BM1 weiß und BM3 cremeweiß in ihrem bevorzugten Medium (BCDA und NA) war. Nach 48-72 Stunden Inkubation war die Farbe von BM2 orange, BM1, D1 waren gelb, C2 war rot und BM3, D2, D3, D4, C3 blieben cremeweiß. Die Kolonietypen der Stämme BM1, BM2, D2 und D4 waren feucht und die übrigen cremig. Staphylokokken und Mikrokokken bilden auf normalen Nährböden goldbraune, gelbe oder weiße Kolonien. Einige Enterokokken, Coryneformen und Enterobakterien können auf gewöhnlichen Nährböden schwarze Kolonien bilden.8

Antagonismus-Assay

Die Kreuzungsmethode wurde angewandt, um den Antagonismus zwischen den Bakterienstämmen für ihre künftige Anwendung in verschiedenen Bereichen zu bestimmen. Einzelheiten zum Antagonismus innerhalb der Bakterienisolate sind beschrieben (Tabelle 3).

BM2 hat Antagonismus mit allen anderen Stämmen, so dass es nicht möglich ist, ein Konsortium mit diesem Stamm als einem der Isolate zu entwickeln. D1, D3 haben auch einen Antagonismus mit den meisten anderen Stämmen. BM1 ist der wirksamste Stamm, da er mit keinem der anderen Isolate einen Antagonismus aufweist. BM3, D2, D4, D5 und D6 haben Antagonismus mit einigen wenigen Isolaten, und diese Stämme können zusammen mit BM1 in verschiedenen Kombinationen zur Herstellung eines Konsortiums getestet werden.

Schwermetalltoleranztest

Fünf Schwermetalle (As, Zn, Pb, Hg, Cd) wurden zur Bestimmung der Metalltoleranzfähigkeit der isolierten Bakterienstämme (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3) ausgewählt. Der Toleranztest zeigte, dass von den fünf untersuchten Schwermetallen eine maximale Toleranz gegenüber Pb bestand, bei der die Mikroorganismen bis zu 4000 ppm wuchsen, und eine minimale Toleranz gegenüber Cd, das oberhalb von 30 ppm nicht wuchs. Die MHK wurde festgestellt, wenn die Isolate auch nach 10 Tagen Bebrütung nicht auf den Platten wuchsen. Das Ergebnis zeigt, dass die MHK für alle drei Bakterien zwischen 250ppm und 350ppm für As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) und Pb (3000-4000ppm) lag (Tabelle 4). In der vorliegenden Studie wurde die höchste As- und Cd-Toleranz in BM1 festgestellt, während die höchste Zn-Toleranz in BM2 beobachtet wurde und BM3 eine maximale Hg- und Pb-Akkumulation aufwies. In unserer Studie ist das giftigste Metall (mit der niedrigsten MHK) Cd, während das am wenigsten toxische getestete Metall Pb ist (Tabelle 4).

MIC wurde festgestellt, wenn die Isolate auch nach 10 Tagen Inkubation nicht auf den Platten wuchsen.18 Mergeay et al.19 testeten die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) verschiedener Metalle und stellten fest, dass das giftigste Metall (mit der niedrigsten MHK) Quecksilber war, während das am wenigsten giftige Metall Mangan war.19 Die mikrobielle Toleranz bei jeder Schwermetallkonzentration wurde durch den Bechertest dargestellt. Der Durchmesser der Hemmzone um jeden Becher nahm mit steigender Schwermetallkonzentration zu, was auf eine toxische Wirkung der Schwermetalle auf das Wachstum der Mikroorganismen hinweist. Die Stadtverwaltung von Barrackpore und die Mülldeponie von Dhapa sammeln alle festen Haushalts- und Industrieabfälle der Stadt Barrackpore bzw. der Stadt Kolkata und ihrer Umgebung. Haushalts- und Industrieabfälle sind ein geeignetes Milieu, in dem die Mikroorganismen eine Resistenz gegen Schwermetalle entwickeln können. Das Vorhandensein geringer Mengen von Schwermetallen in festen Abfällen kann die Entstehung von schwermetallresistenten Mikroorganismen begünstigen. Die mikrobielle Resistenz gegen Schwermetalle wird auf eine Vielzahl von Entgiftungsmechanismen zurückgeführt, die von resistenten Mikroorganismen entwickelt werden, wie z. B. Komplexbildung durch Exopolysaccharide, Bindung an bakterielle Zellhüllen, Metallreduktion, Metallausschleusung usw. Diese Mechanismen werden manchmal in Plasmidgenen kodiert, die die Übertragung der Resistenz gegen toxische Metalle von einer Zelle auf eine andere erleichtern.20 Der schwermetallresistente Organismus könnte ein potenzielles Mittel zur Bioremediation von Schwermetallverschmutzungen sein. Da alle Schwermetalle in ihrem toxischen Mechanismus ähnlich sind, sind multiple Metalltoleranzen ein häufiges Phänomen bei schwermetallresistenten Bakterien.21

Antibiotika-Empfindlichkeitstest

Antibiotika-Empfindlichkeitstest hilft zu bestimmen, wie wirksam ein Antibiotikum gegen den Testorganismus ist. Die 9 Isolate wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber vier Antibiotika untersucht, und das Ergebnis ist in Tabelle 5 aufgeführt. Die meisten Isolate produzieren antimikrobielle Verbindungen, die für die medizinische Wissenschaft von Nutzen sein können. D1, D3 und D5 zeigten keine antimikrobielle Aktivität.

Test auf antimikrobielle Aktivität

Die Produktion antimikrobieller Verbindungen scheint ein allgemeines Phänomen der meisten Bakterien zu sein. In der vorliegenden Studie zeigten 3 Isolate antibakterielle Aktivität und 5 Isolate antimykotische Aktivität, aber 3 Isolate zeigten weder antibakterielle noch antimykotische Aktivität gegen die Krankheitserreger. Das Ergebnis wurde dargestellt (Tabelle 6). Über eine ähnliche Studie berichteten Subramaniam et al.22 Eine Vielzahl von antimikrobiellen Verbindungen wird von Mitgliedern der Gattung Bacillus produziert, von denen viele als Peptide, Lipopeptide und Phenolderivate identifiziert wurden. Die Suche nach neuartigen Sekundärmetaboliten mit unterschiedlicher biologischer Aktivität in verschiedenen Umgebungen hat in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen.

Extrazelluläre Enzymproduktion

Mit dem wachsenden Bewusstsein für den Umweltschutz hat die Verwendung von Enzymen, insbesondere von extremophilen Organismen, in vielen industriellen Prozessen große Aufmerksamkeit erlangt. In den letzten Jahren haben mikrobielle Enzyme chemische Katalysatoren bei der Herstellung von Chemikalien, Textilien, Pharmazeutika, Papier und landwirtschaftlichen Lebensmittelchemikalien ersetzt. Enzymbasierte industrielle Bioprozesse stehen nun in direkter Konkurrenz zu etablierten chemischen Prozessen. In dieser Studie wurden die 9 Isolate jedoch einem qualitativen Test auf die Produktion von acht verschiedenen Enzymen wie Protease, Lecithinase, DNase, Lipase, Cellulase, Amylase, Katalase und Oxidase unterzogen. Eine ähnliche Studie wurde von Subramani und Narayanasamy durchgeführt.23 Interessanterweise produzierten in unserer Studie 6 Stämme das Enzym Protease, das einen hohen Marktwert hat. Alle 9 Stämme produzierten Katalase- und Oxidase-Enzyme. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.

Proteasetest

6 Stämme (BM1, BM3, D1, D3, C2 und C3) der 9 Isolate wiesen eine Proteaseproduktion auf. Da die Protease eine breite Anwendung in der Lebensmittel-, Waschmittel- und Pharmaindustrie sowie beim Abbau fester Abfälle findet, wurde ein quantitativer Test der produzierten Protease durchgeführt. Die Aktivität des so produzierten Protease-Enzyms wurde bestimmt und das Ergebnis in IU/ml ausgedrückt. Das Ergebnis ist dargestellt (Tabelle 8). Der quantitative Proteasetest ergab, dass von den 6 Stämmen BM1 Protease mit einem hohen Titerwert produziert, und Gupta et al. berichteten in ähnlicher Weise über die Produktion von alkalischer Protease aus Bakterienarten und deren industrielle Anwendung.

Abbau von Abfällen durch isolierte Bakterien

Das Enzym Protease findet breite Anwendung beim Abbau von Abfällen. Daher wurden die 6 Stämme, die in der Lage sind, Protease-Enzyme zu produzieren, einem Test zur Effizienz des Abfallabbaus unterzogen. In unserer Studie konnte festgestellt werden, dass BM1 das höchste Abbaupotenzial hat, gefolgt von BM3. BM1 ist auch ein starker Produzent von Protease-Enzymen und besitzt daher auch eine bessere Abbaubarkeit (Abbildung 1). Wenn der Abfall von Mikroorganismen (Bakterien) abgebaut wird, nimmt das Gewicht der Einstreu ab. In der vorliegenden Zersetzungsstudie konnten wir beobachten, dass das Gewicht der behandelten Abfälle abnahm, weil die Bakterien sie abbauten und in einfache Moleküle umwandelten. Der prozentuale Gewichtsverlust der Abfallproben nahm mit dem Fortschreiten des Zersetzungsprozesses zu, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Ähnliche Beobachtungen wurden von Zaved et al.25 bei der Untersuchung des Gewichtsverlusts von Müll durch bestimmte Bakterien in Bangladesch gemacht. In unserer Studie konnte festgestellt werden, dass BM1 das höchste Abbaupotenzial aufweist. Somit kann BM1 effizient zur Bioremediation fester Abfälle eingesetzt werden.