GroEL/GroES-Zyklus: ATP bindet an einen offenen Ring vor dem Substratprotein, was die Proteinbindung und die Herstellung des nativen Zustands begünstigt

Ergebnisse

Rapid ATP Binding to GroEL as Revealed by Fluorescence Intensity Changes of GroEL F44C Labeled with Oregon Green 488.

Um die Bindung von ATP durch GroEL zu überwachen, stützten wir uns auf eine zuvor hergestellte GroEL-Variante, F44C, die ein einzelnes Cystein in einer ansonsten „Cystein-Null“-Version von GroEL enthält, bei der alle drei natürlichen Cysteine in der GroEL-Untereinheit (Aminosäuren 138, 458 und 519) durch Alanin ersetzt worden waren (21). Wie in Abb. 1A dargestellt, liegt F44 in einer Schleife, die auf der Höhe der äquatorialen Domäne nach oben in den zentralen GroEL-Hohlraum zeigt und zwischen äquatorialen antiparallelen β-Strängen positioniert ist, an deren Enden sich Reste befinden, die über ein Wassermolekül und ein Kaliumion Wasserstoffbrückenbindungen mit dem terminalen Phosphat des gebundenen ATP bilden. Die Schleife und der Rest 44 sind daher so angeordnet, dass sie durch die Abwesenheit bzw. Anwesenheit von ATP beeinflusst werden. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass eine F44W-Substitution einen Einfluss auf die ATP-Bindung haben könnte (16). Hier wurde die Mutante F44C verwendet, die sich als voll funktionsfähig erwiesen hatte, wie die Fähigkeit ihres kodierenden Plasmids, das Wachstum einer GroEL-defizienten Mutante zu retten, und die Fähigkeit des gereinigten Proteins, eine effiziente ATP/GroES-abhängige Proteinrückfaltung in vitro durchzuführen, zeigen (21). F44C wurde mit Oregon Green 488 (OG488)-Maleimid bis zu einem Grad von ≈70% markiert. Es blieb bei der Vermittlung der Rückfaltung von Malatdehydrogenase (MDH) in vitro voll funktionsfähig und zeigte eine Kinetik, die mit der von WT GroEL nahezu identisch war. Die Steady-State-Rate des ATP-Umsatzes durch die modifizierte Mutante, EL44-OG genannt, ähnelte ebenfalls der von WT GroEL (Abb. S1B).

Fluoreszenzemissionsspektren von EL44-OG (angeregt bei 496 nm) zeigten, dass die Zugabe von ATP einen starken Abfall der Fluoreszenzintensität im stationären Zustand (≈65 % bei 500 μM ATP) erzeugte, begleitet von einer kleinen Blauverschiebung des Emissionsmaximums (Abb. 1B). Im Gegensatz dazu führte ADP zu einem geringeren Abfall der Intensität, was darauf hindeutet, dass das γ-Phosphat von ATP eine spezifische Wirkung auf die Konformation der 44-enthaltenden Schleife hat.

Beim Mischen von 0,5 mM ATP mit EL44-OG im gestoppten Fluss wurde ein schneller Abfall der Emissionsintensität beobachtet, mit einer Kurve, die als Summe von 2 Exponentialen angepasst werden konnte, eine mit einer Geschwindigkeitskonstante von ≈100 s-1 und eine andere mit einer Geschwindigkeitskonstante von 4 s-1 (Abb. 1C). Die erste Rate deutet auf eine schnelle Interaktion von ATP mit unligandiertem GroEL hin und entspricht den Raten, die früher sowohl für F44W (Ref. 16; 80 ± 5 s-1) als auch für zwei andere Tryptophan-substituierte Versionen von GroEL berichtet wurden: Y485W, wo ein Tryptophan an anderer Stelle in der äquatorialen Domäne ersetzt wurde (Ref. 18; 123 ± 2 s-1), und R231W (Ref. 17; 80 s-1), bei dem ein Tryptophan in der dem Hohlraum zugewandten Seite der apikalen Domäne ersetzt wurde (GroEL ist ansonsten frei von Tryptophan). Wie erwartet war die Wechselwirkungsgeschwindigkeit von ATP mit EL44-OG von der ATP-Konzentration abhängig (Abb. 1D), und für die schnellere Phase wurde eine bimolekulare Geschwindigkeitskonstante von 2 × 105 M-1 s-1 ermittelt. Die langsamere kinetische Phase, die ebenfalls von der ATP-Konzentration abhängt, entspricht wahrscheinlich der dritten Fluoreszenzphase, die für GroELs R231W und Y485W bei der ATP-Bindung beobachtet wurde (17, 18). Die Möglichkeit, dass diese Phase die ATP-Hydrolyse widerspiegelt, wurde durch die Verwendung eines hydrolyse-defekten D398A/EL44-OG-Chaperonins ausgeschlossen.

Gleich schnelle Fluoreszenzänderung bei ATP-Bindung an den offenen trans-Ring des asymmetrischen GroEL/GroES/ADP-Komplexes.

Unter physiologischen Bedingungen ist der normale Akzeptorzustand für ATP der offene trans-Ring eines asymmetrischen GroEL/GroES/ADP-Komplexes. Beim Mischen mit gestopptem Fluss beobachteten wir, dass die ATP-Bindungsrate an den trans-Ring von EL44-OG/GroES/ADP-Komplexen ähnlich war wie die an einen unligandierten GroEL-Ring (Abb. 1E, vgl. Abb. 1F). Auch hier gab es eine ATP-Konzentrationsabhängigkeit, die der von unligandiertem EL44-OG ähnelte (Abb. 1D).

Substrat-Polypeptid, das an den trans-Ring gebunden ist, beeinflusst die ATP-Bindungsrate nicht.

In einer Reihe von in vitro-Studien wurde ein nicht-natives Polypeptid zunächst an den offenen trans-Ring eines asymmetrischen ADP-GroEL/GroES-Komplexes gebunden, bevor ATP und überschüssiges GroES hinzugefügt wurden (8, 9). Unter diesen Bedingungen ist die ATP-Bindung, gefolgt von der Bindung von GroES, eindeutig in der Lage, das nicht-native Polypeptid einzukapseln und die produktive Faltung zu steuern. Wird die ATP-Bindungsrate in einem solchen Kontext durch das gebundene Substratprotein beeinflusst? Um dies zu testen, wurde nicht-natives MDH an die asymmetrischen EL44-OG/GroES/ADP-Komplexe gebunden und anschließend ATP unter Stoppstrom-Mischung zugegeben. Unter diesen Bedingungen war die Änderungsrate der Fluoreszenzintensität praktisch identisch mit der des EL44-OG/GroES/ADP-Komplexes in Abwesenheit des Polypeptids (vgl. Abb. 1G und Abb. 1E). Somit hat die Anwesenheit eines nicht nativen Substrats, das an die apikalen Domänen des trans-Rings gebunden ist, keinen nachweisbaren Einfluss auf den schnellen Eintritt von ATP in die äquatorialen Nukleotid-Bindungstaschen des trans-Rings.

Rapid Apical Domain Movement Accompanies ATP Binding.

Wenn ATP schnell an GroEL bindet, bewirkt dies eine signifikante Anpassung in den apikalen Polypeptid-Bindungsdomänen auf der gleichen schnellen Zeitskala, oder sind die apikalen Veränderungen als Reaktion auf die ATP-Bindung relativ langsam, so dass die Auswirkungen der ATP-Bindung als zu einem späteren Zeitpunkt auftretend betrachtet werden müssen? Die frühere Studie zu R231W hatte bereits gezeigt, dass die apikalen Effekte bei dieser Mutante schnell auftreten (17). Auch in der vorliegenden Studie zeigte eine fluoreszierende Sonde auf der Außenseite der apikalen Domänen, die von der ATP-Bindungsstelle auf der Innenseite des Zylinders entfernt ist (GroEL E315C in einem Cystein-Null-Hintergrund, markiert mit OG), eine rasche Änderung der Fluoreszenzintensität, und zwar auf derselben Zeitskala wie die ATP-Bindung. So wurde beispielsweise für einen asymmetrischen GroEL315-OG/GroES/ADP-Komplex bei einer ATP-Konzentration von 150 μM eine Geschwindigkeitskonstante von 20 s-1 beobachtet (Abb. 1H, vgl. 25 s-1 in Abb. 1E). Solche apikalen Veränderungen traten in demselben Ring auf, an den ATP gebunden ist, da die Analyse einer OG-modifizierten Einzelringversion von E315C, SR315-OG, eine ähnliche Änderungsrate der Fluoreszenzintensität ergab (Abb. 1I). Die Geschwindigkeit der apikalen Bewegung war auch von der ATP-Konzentration abhängig, wobei die Raten parallel zu denen der ATP-Bindung verliefen (Abb. S2, vgl. Abb. 1D).

Relativ langsame Bindung von Substratpolypeptid, gemessen durch FRET.

Um einen Vergleich der Geschwindigkeit der Bindung von nicht-nativem Substratpolypeptid mit der der ATP-Bindung zu ermöglichen, haben wir als nächstes die Geschwindigkeit der Bindung von Substratproteinen an asymmetrische GroEL/GroES/ADP-Komplexe mit FRET gemessen. Es wurden drei verschiedene Substratproteine untersucht: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) und eine doppelt mutierte Form des Maltose bindenden Proteins (DM-MBP; 41 kDa). Alle drei Proteine verhalten sich bei 25 °C als stringente Substratproteine und benötigen die Anwesenheit von GroEL, GroES und ATP, um ihre native Form zu erreichen (3). In ihrer Abwesenheit kommt es zu einer quantitativen Aggregation. Zur Überwachung der Bindung wurde FRET zwischen dem mit Cumarinpropylmaleimid (CPM; Donor) an einem Cysteinrest markierten Substratprotein (siehe Materialien und Methoden) und EL44-OG (Akzeptor) gemessen. Bei Anregung mit dem Anregungsmaximum für CPM (384 nm) wurden Emissionsspektren für die CPM (Donor)-markierten Substrate, während sie an unmarkiertes GroEL gebunden waren (Abb. 2A, DM-MBP-CPM als Beispiel, schwarze Spur), für EL44-OG, das mit unmarkiertem Substrat komplexiert war (Abb. 2A, Akzeptor markiert, blaue Spur), oder für Komplexe mit CPM-markiertem Substrat, das an EL44-OG gebunden war (Abb. 2A, rote Spur), gesammelt. Sowohl bei DM-MBP-CPM als auch bei MDH-CPM kam es bei der Assoziation mit EL44-OG zu einem starken Donor-Löschen; gleichzeitig trat ein erhebliches Akzeptorsignal auf.

Beim Mischen von 125 nM DM-MBP-CPM mit 125 nM EL44-OG im gestoppten Fluss wurde ein Abfall der Donor-Emissionsintensität beobachtet, mit einer Kurve, die als Summe von zwei Exponentialen angepasst werden konnte, eines mit einer Geschwindigkeitskonstante von 1,33 s-1 und das andere mit einer Geschwindigkeitskonstante von 0,65 s-1 (Abb. 2B). Die schnellere Rate (k1) war von der Chaperoninkonzentration abhängig (Abb. 2C), die langsamere jedoch nicht. Bei einer GroEL-Konzentration von 125 nM (Abb. 2B) ist die Geschwindigkeit der Substratpolypeptidbindung (k1 = 1,33 s-1) 60-mal langsamer als die ATP-Bindungsgeschwindigkeit (100 s-1 bei 500 μM ATP; Abb. 1C). Obwohl die Substratbindungsrate bei einer physiologischen GroEL-Konzentration von 1-2 μM (Abb. 2C) um ein Vielfaches höher sein dürfte, wäre die ATP-Bindungsrate wahrscheinlich ebenfalls etwas höher, wenn man bedenkt, dass die physiologische ATP-Konzentration mehrere Millimol beträgt (Abb. 1D). Daher ist die ATP-Ankunftsrate unter physiologischen Bedingungen wahrscheinlich mindestens 10-mal höher als die Substrat-Ankunftsrate.

In einem weiteren Test hatte die Zugabe von ATP zur gleichen Zeit wie fluoreszierend markiertes DM-MBP einen reproduzierbaren Effekt auf die Erhöhung der DM-MBP-Bindungsrate (Abb. 2D und Tabelle S2). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die physiologische Reihenfolge der Zugabe zu einem trans-Ring ein schnelles Eintreffen von ATP gefolgt von einem langsameren Eintreffen des Substratproteins zu umfassen scheint. Diese Reihenfolge steht im Gegensatz zu der in neueren Studien programmierten Reihenfolge, bei der zunächst Polypeptid an den trans-Ring gebunden und dann ATP hinzugefügt wurde (8, 9). Hat die Reihenfolge der Zugabe einen messbaren Einfluss auf die Rückfaltung des Substratproteins? Um dies zu prüfen, haben wir Experimente mit der Reihenfolge der Zugabe durchgeführt und die Wiederherstellung des nativen Enzyms unter Bedingungen mit im Wesentlichen nur einer Umdrehung gemessen.

Größere Wiederherstellung des nativen Zustands, wenn zuerst ATP und dann Polypeptid zugegeben wird, verglichen mit der umgekehrten Reihenfolge.

Ein Experiment mit der Reihenfolge der Zugabe wurde mit der Einzelringversion von GroEL, SR1, durchgeführt, was eine „Ein-Runden“-Analyse ermöglicht. Das von SR1 eingefangene Polypeptid wird nach der Bindung von GroES innerhalb des langlebigen cis-Hohlraums des stabilen SR1/GroES-Komplexes nahezu quantitativ in die native Form gefaltet (10, 11). So konnte SR1 mit ATP und nicht-nativem Polypeptid in beliebiger Reihenfolge inkubiert werden, gefolgt von der Zugabe von GroES, und das Ausmaß der Wiederherstellung des nativen Proteins konnte sowohl in Abhängigkeit von der Reihenfolge der Zugabe als auch vom Intervall zwischen den Zugaben gemessen werden (Abb. 3A). Bei diesen Tests wurde GroES 2 Sekunden nach ATP/Polypeptid zugegeben, damit die anfänglichen Wechselwirkungen abgeschlossen werden konnten. In einem ersten Experiment beobachteten wir reproduzierbar, dass das Ausmaß der Wiederherstellung von Rubisco in nativer Form nur ≈30 % betrug, wenn zuerst nicht-natives Rubisco und 2 Sekunden später ATP zugegeben wurde. Im Vergleich dazu betrug die Wiederherstellung >60 %, wenn zuerst ATP zugegeben wurde, und ≈70 %, wenn ATP und GroES zu einem präformierten binären Rubisco-SR1-Komplex (hergestellt durch eine 10-minütige Inkubation von nicht-nativem Rubisco mit SR1) zugegeben wurden. Dies deutet darauf hin, dass im Rahmen einer zyklischen Reaktion, bei der der trans-Ring eines Akzeptor-GroEL/GroES/ADP-Komplexes offen und für die Bindung von Polypeptid nur ≈1-2 s vor der Bindung von GroES verfügbar ist, die Mobilisierung seiner apikalen Domänen durch schnelle ATP-Bindung die Bindung von nicht-nativem Polypeptid begünstigt. Die umgekehrte Reihenfolge, d. h. die Zugabe des Polypeptids 2 s vor der ATP-Bindung, scheint für die Bindung weniger günstig zu sein, auch wenn die ATP-mobilisierten apikalen Domänen anschließend 2 s vor der GroES-Zugabe verfügbar waren. Als das Intervall zwischen den Rubisco- und ATP-Zugaben auf 4 s erhöht wurde (Abb. 3A), wurde der Effekt der Reihenfolge der Zugabe aufgehoben, wobei die Kinetik und das Ausmaß der Erholung nun denen der ersten ATP-Zugabe entsprachen, was vermutlich auf eine umfangreichere Polypeptidbindung während des Intervalls vor der ATP-Zugabe zurückzuführen ist. Obwohl das Ausmaß der Erholung von Rubisco in den Studien in der Reihenfolge der Zugabe mit einem 2-s-Intervall signifikant beeinflusst wurde, war die Kinetik der Erholung des nativen Zustands innerhalb der stabilen SR1/GroES-Komplexe ähnlich, was mit einem Effekt auf die Bindung des Substratproteins und nicht auf die Faltungsrate in der gekapselten Kammer übereinstimmt.

Größere Bindung von Rubisco mit zuerst zugegebenem ATP.

Um die Auswirkung der Reihenfolge der Zugabe auf die Bindung des Substratproteins zu untersuchen, verwendeten wir 35S-markiertes Rubisco und maßen die Menge, die während der Inkubationen in der Reihenfolge der Zugabe von SR1 gebunden wurde, indem wir die Gel-Filtration der Endproduktmischungen verwendeten, um die stabilen SR1/GroES/Rubisco-Komplexe von ungebundenem Polypeptid zu trennen. Dabei zeigte sich, dass ≈10.000 cpm 35S-Rubisco gebunden hatten, wenn 40.000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) 2 Sekunden vor ATP zugegeben wurden, und dass ≈30.000 cpm gebunden hatten, wenn ATP 2 Sekunden vor Rubisco zugegeben wurde (Abb. 3B). Das letztgenannte Ausmaß der Bindung wurde auch erreicht, wenn SR1-Rubisco-Binärkomplexe, die über einen Zeitraum von 10 min gebildet wurden, anschließend mit ATP und GroES zusammen inkubiert wurden (Abb. 3B). Diese Messungen des Ausmaßes der Substratbindung verlaufen somit parallel zum Ausmaß der Wiederherstellung der Enzymaktivität (vgl. Abb. 3B mit Abb. 3A) und stützen die Schlussfolgerung, dass im Kontext eines 2-s-Intervalls zwischen der Zugabe von ATP/Polypeptid die Zugabe von ATP zunächst eine effizientere Substratproteinbindung begünstigt.

Größere Rate der Rubisco-Bindung an einen ATP-exponierten Chaperonin-Ring.

Die obige Beobachtung eines größeren Ausmaßes der Rubisco-Bindung in einem Experiment, bei dem ATP in der Reihenfolge der Zugabe zu Beginn hinzugefügt wird, legt nahe, dass die Rate der Rubisco-Assoziation mit ATP-mobilisierten apikalen Domänen größer sein könnte. Um dies zu testen, wurde eine ATP-Hydrolyse-defiziente D398A-Version von SR1 mit OG an einem an Position 44 substituierten Cystein (in einem C138A-Hintergrund) verwendet, um mittels FRET über die Bindungsrate von CPM-markiertem Rubisco zu berichten (Abb. 3 C-E). Wir beobachteten, dass die Bindungsrate von Rubisco, die unter den gleichen Bedingungen wie bei den vorangegangenen Experimenten zur Reihenfolge der Addition durchgeführt wurde, in Gegenwart von ATP um das Zweifache höher war als in Abwesenheit von ATP (vgl. Abb. 3D und Abb. 3C). Wenn ATP und nicht-natives Rubisco gleichzeitig zugegeben wurden, was der physiologischen Situation entspricht, ähnelte die Bindungsrate von Rubisco derjenigen, wenn ATP vor Rubisco zugegeben worden war (Abb. 3E, vgl. Abb. 3D). Diese Daten belegen, dass Rubisco schneller mit einem Ring assoziiert, dessen apikale Domänen ATP-mobilisiert wurden, und dass unter physiologischen Bedingungen, in denen sowohl ATP als auch nicht-natives Substrat vorhanden sind, die ATP-mobilisierten apikalen Domänen für die Substratbindung verantwortlich sind.