Frontiers | Myosin Light Chain Kinase: Ein potenzielles Ziel für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen | Pharmakologie

In Säugetieren wird die Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK) von den Genen mylk1 und mylk2 kodiert (Herring et al., 2006). mylk2 kodiert eine MLCK-Isoform, die ausschließlich in Skelettmuskelzellen exprimiert wird (Herring et al., 2006; Wang L. et al., 2016). Aufgrund des Mangels an Daten zu den kodierenden Produkten des mylk2-Gens werden hier hauptsächlich die Produkte des mylk1-Gens behandelt, zu denen langkettiges MLCK (220 kDa), kurzkettiges MLCK (130 kDa) und das nichtkatalytische carboxyterminale (17 kDa) Protein Telokin gehören (Chen et al, 2013; Chen C. et al., 2014; An et al., 2015). Die für das mylk1-Gen kodierenden Produkte werden in verschiedenen Zelltypen und Geweben exprimiert, darunter Muskeln, Blutplättchen sowie sekretorische und Gehirnzellen (Jin et al., 2002). Zahlreiche Zellaktivitäten wie Kontraktion, Adhäsion, Zellmigration und epitheliale Barrierebildung erfolgen in Abhängigkeit oder unabhängig von der Phosphorylierung der myosinregulatorischen leichten Kette (MLC) (Chen et al., 2013; Chen C. et al., 2014; Kim und Helfman, 2016). Eine abnorme Expression von MLCK wurde bei vielen Entzündungskrankheiten wie Pankreatitis (Shi et al., 2014), Atemwegserkrankungen (Zhou et al., 2015), Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Cheng et al., 2015), Krebs (Zhou et al., 2014) und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) (Yi et al., 2014) beobachtet. Die Beteiligung von MLCK und dem MLCK-Signalweg, die repräsentativen Entzündungskrankheiten zugrunde liegen, wird diskutiert. Einige Krankheiten, an denen MLCK beteiligt ist, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

TABLE 1

TABLE 1. Rolle der Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK) bei ausgewählten Krankheiten.

MLCK bei Atemwegserkrankungen, Atherosklerose und Pankreatitis

Bei entzündlichen Lungenerkrankungen führt die Schädigung der Integrität der Lungenendothelzellen zu einer veränderten Gefäßpermeabilität, was häufig zu einer Überflutung der Alveolen führt (Mao et al., 2015). Bei Lungenverletzungen kommt es zu einer abnormalen Expression von MLCK, und der MLCK-Inhibitor ML-7 oder die Deletion des MLCK-Gens können Lungenverletzungen abschwächen (Wang T. et al., 2016). MLCK hat eine ähnliche Aktivität bei Asthma und Lungenentzündung, und eine Variation des MYLK-Gens ist stark mit akuter Lungenverletzung und Asthmaanfälligkeit assoziiert (Wang et al., 2014, 2015; Wang T. et al., 2016).

MLCK-induzierte endotheliale Barrieredysfunktion ist auch an Pankreatitis und Atherosklerose beteiligt (Cheng et al., 2015; Wang et al., 2014; Wang T. et al., 2016). Schwere akute Pankreatitis ist mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden. Ihre Pathogenese ist nicht vollständig geklärt (Zerem, 2014), aber die MLCK-Expression ist in Rattenmodellen der akuten Pankreatitis signifikant erhöht (Shi et al., 2014), und es hat sich gezeigt, dass die Erhöhung des Tumornekrosefaktors (TNF)-α bei schwerer akuter Pankreatitis eine MLCK-abhängige Regulierung des Zytoskeletts vermittelt, was zur Zerstörung der endothelialen Barrierefunktion führt (Shi et al., 2014; Yu et al., 2016). Die Auslösung und Entwicklung von Atherosklerose führt häufig zu einer fortschreitenden Gefäßschädigung, die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergeht (Phinikaridou et al., 2015). Die Beteiligung von MLCK an der natürlichen Geschichte der Atherosklerose wurde durch die Linderung von Gefäßverletzungen und Atherosklerose durch ML-7, einen MLCK-Inhibitor, bestätigt (Cheng et al, 2015).

MLCK in der Krebsentwicklung

Eine abnorme Expression von MLCK wurde in Zelllinien von Bauchspeicheldrüsen-, Lungen- und Prostatakrebs beobachtet (Tohtong et al., 2003; Nagaraj et al., 2010; Chen et al., 2011). Schnelle, dynamische Veränderungen des Zytoskeletts sind für die Invasion und Metastasierung von Krebszellen erforderlich. Die MLCK-abhängige Phosphorylierung von Myosin II des Zytoskeletts erhöht das metastatische Potenzial von Tumorzellen, und die MLCK-abhängige Umstrukturierung des Zytoskeletts moduliert die Funktionen der vaskulären Endothelbarriere im Zusammenhang mit der Angiogenese, die ein kritischer Schritt in der Krebsentwicklung ist (Dudek und Garcia, 2001). Andererseits wird das metastatische Potenzial von Brustkrebszellen durch den Verlust von MLCK erhöht (Kim und Helfman, 2016). Veränderungen der Zellmigration und -adhäsion sind ebenfalls charakteristische frühe Schritte bei Entzündungen, aber es gibt nur wenige Berichte über die Regulierung der Migration von Entzündungszellen durch MLCK.

MCLK in IBD

Entzündliche Darmerkrankungen, einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, sind durch chronische gastrointestinale Entzündungen gekennzeichnet und gehen mit erheblichen Beeinträchtigungen der Patienten und hohen Behandlungskosten einher (Rai et al., 2015). Obwohl die Pathogenese von CED nach wie vor unklar ist, gibt es Hinweise darauf, dass eine Dysfunktion der Darmbarriere die Hauptursache ist (Hindryckx und Laukens, 2012; Pastorelli et al., 2015). Eine Dysfunktion der Tight Junctions führt zu einer Schädigung der Darmbarriere, die das Eindringen verschiedener Krankheitserreger ermöglicht (Jin und Blikslager, 2016). Tight Junctions bestehen aus Transmembranproteinen wie Occludinen und Claudinen und peripheren Membranproteinen, d. h. Zonula-Occludens-Proteinen (Van Itallie und Anderson, 2014). Tight Junctions befinden sich in der apikolateralen Region von Endothelzellen und sind an einen perijunktionellen Aktomyosinring gebunden. Die MLCK-induzierte Phosphorylierung von perijunktionellem Aktomyosin vermittelt den Verlust von Tight Junctions, was die Auslösung und Entwicklung von IBD auslösen kann. Die Expression und Aktivität von MLCK ist bei IBD beim Menschen erhöht und steht in Zusammenhang mit histologischen Anzeichen von Krankheitsaktivität (Blair et al., 2006). Eine abnormale Erhöhung von MLCK wurde auch bei experimenteller Kolitis beobachtet, die durch die Verabreichung von Dextransulfat-Natrium über die Magensonde oder von Trinitrobenzolsulfonsäure intrakolonisch ausgelöst wurde (Su et al., 2013; Xiong et al., 2016).

MLCK-Aktivierung bei IBD

TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das eine Dysfunktion der intestinalen Tight-Junction-Barriere verursacht, die eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von IBD spielt (Saleh et al., 2016). Bei IBD trägt die durch TNF-Rezeptor 2 (R2) vermittelte Signalübertragung zu einer erhöhten epithelialen MLCK-Expression bei (Su et al., 2013; Suzuki et al., 2014). In einem kürzlich erschienenen Bericht von Al-Sadi et al. (2013) wurde die Permeabilität der tight junction von Caco-2-Zellmonolayern in einem In-vitro-Modell des Darmepithels durch TNF-α-Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs erhöht. Die Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs induzierte die Phosphorylierung des ETS-Domäne-enthaltenden Transkriptionsfaktors Elk-1. Das aktivierte Elk-1 wanderte dann in den Zellkern und band an den MLCK-Promotor, was schließlich zur epithelialen MLCK-Expression führte. LIGHT (Lymphotoxin-ähnliches induzierbares Protein, das mit Glykoprotein D um den Eintritt von Herpesviren in T-Zellen konkurriert) ist ein Mitglied der TNF-Kernfamilie, das an der Pathogenese der menschlichen IBD beteiligt ist (Krause et al., 2014), und in kultivierten Epithelien milderte die MLCK-Hemmung den LIGHT-induzierten Barriereverlust, was darauf hindeutet, dass der LIGHT-induzierte epitheliale Barriereverlust von der MLCK-Aktivierung abhängen könnte (Schwarz et al., 2007).

Erhöhungen der Permeabilität der tight junctions durch IL-1β-vermittelte Steigerungen der MLCK-Expression wurden bei entzündlichen Erkrankungen nachgewiesen (Beard et al., 2014). Bei der Migration von mesenchymalen Stammzellen wurde gezeigt, dass IL-1β durch die Aktivierung des PKCd/NF-κB-Signalwegs einen Anstieg der epithelialen MLCK-Expression verursacht; es stimulierte auch die MLCK-Aktivität über den PKCa/MEK/ERK-Signalweg (Lin et al., 2014).

IFN-γ wurde ebenfalls mit der Aktivierung von MLCK in Verbindung gebracht, indem es die Adhäsion und Internalisierung von kommensalen Bakterien durch epitheliale MLCK-aktivierte Bürstensaumfächer fördert (Wu et al., 2014). Wie bei der LICHT-vermittelten Regulierung von MLCK sind jedoch weitere Untersuchungen der INF-γ-vermittelten Regulierung von MLCK erforderlich, um festzustellen, ob sie direkt ist. Die mit der Regulierung von MLCK verbundenen Signalwege sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

MLCK-assoziierte Signalwege, die IBD auslösen können

Bei IBD wird die MLCK-induzierte epitheliale Barrieredysfunktion durch zwei Signalwege ausgelöst. Zum einen bildet das Epithel im Darm eine Barriere gegen Krankheitserreger im Lumen. Eine abnorme Expression von MLCK bei entzündlichen Magen-Darm-Erkrankungen führt zu einer Phosphorylierung der regulatorischen Myosin-II-Leichtkette (MLC), einer Kontraktion des Aktomyosinrings und einer erhöhten Darmpermeabilität (Yi et al., 2015). Somit ist die MLCK-abhängige MLC-Phosphorylierung ein wesentlicher Mechanismus, der der MLCK-induzierten Dysfunktion der Epithelbarriere zugrunde liegt. Ein zweiter Mechanismus umfasst die durch MLCK stimulierte Hochregulierung von Claudin-2 und die Occludin-Endozytose (Su et al., 2013; Jin und Blikslager, 2016). Eine erhöhte Expression von Claudin-2 wurde mit einer Dysfunktion der intestinalen Epithelbarriere in Verbindung gebracht (Hu et al., 2015; Krishnan et al., 2015) sowie mit verminderter Absorption, Leckflussdiarrhöe und Entzündungsreaktionen (Hu et al., 2015). Die Herunterregulierung von Occludin bei IBD verringert die gastrointestinale Permeabilität, was die Integrität der Barriere gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern stören kann (Yin et al., 2015).

Potenzielle pathologische Rolle von MLCK der glatten Muskulatur bei IBD

MLCK der glatten Muskulatur (sm) wird von demselben Gen wie MLCK des Epithels transkribiert. Es ist an der Regulierung der sm-Kontraktion beteiligt, und eine Veränderung des smMLCK-Gehalts führt zu Motilitätsstörungen (Chen et al., 2015). Die Motilitätsstörungen verursachen sekundär ein abnormales Wachstum der Darmflora, was wiederum die Pathogenese von Darmentzündungen verschlimmert (Chen D. et al., 2014; Welch et al., 2014). Ob es eine direkte Wirkung von smMLCK auf Entzündungskrankheiten gibt, muss weiter untersucht werden.

MLCK-Inhibitoren mit potenzieller pharmazeutischer Verwendung

Die Myosin-Leichtkettenkinase verfügt über katalytische, inhibitorische und Calmodulin-bindende Domänen (Chang et al., 2016). Die Aktivität der katalytischen Domäne kann durch partiellen tryptischen Verdau offengelegt werden und kann durch MLCK-Inhibitoren blockiert werden (Luck und Choh, 2011; Chang et al., 2016). MLCK-Inhibitoren wirken durch kompetitive Bindung an oder in der Nähe der ATP-Bindungsstelle auf dem MLCK-Molekül (Saitoh et al., 1987; Luck und Choh, 2011). MLCK wurde ausführlich in sm untersucht, ist aber auch in tierischen Zellen und Geweben weit verbreitet. Daher ist die Bestimmung der MLCK-Aktivitäten in anderen Geweben von entscheidender Bedeutung; MLCK-Inhibitoren sind hierfür gute Werkzeuge. MLCK-Inhibitoren haben auch ein pharmakologisches Potenzial als gefäßerweiternde und entzündungshemmende Mittel. Einige MLCK-Inhibitoren, ihre Herkunft und der Nachweis ihrer pharmakologischen Wirkung sind in Tabelle 2 aufgeführt.

TABELLE 2

TABELLE 2. Myosin-Leichtkettenkinase-Inhibitoren mit potenzieller pharmazeutischer Verwendung.

ML-9 und ML-7

ML-9 ist ein klassischer MLCK-Inhibitor (IC50 = 3,8 μM), der sowohl Ca2+-Calmodulin-abhängige als auch -unabhängige smMLCK hemmt (Saitoh et al., 1987; Shi et al., 2007). Sowohl ML-9 als auch seine synthetischen Derivate sind gute selektive Inhibitoren von smMLCK (Ito et al., 2004). ML-9 senkt nachweislich den Augeninnendruck in Kaninchenaugen (Honjo et al., 2002).

Ein weiterer MLCK-Inhibitor, ML-7 , ist ein membrandurchlässiger Wirkstoff (Shi et al., 2007). Sowohl ML-9 als auch ML-7 sind Naphthalinsulfonamid-Derivate (Shi et al., 2007). Die Hemmung von ML-7 ist mehr als 30-mal stärker als die von ML-9 (IC50 = 300 nM) (Shi et al., 2007). Im Vergleich zu ML-9 kann die spezifische MLCK-Hemmung von smMLCK und anderen MLCK-Isoformen jedoch weniger stark sein (Saitoh et al., 1987). Die positive Wirkung von ML-7 wurde bei vielen Erkrankungen nachgewiesen, darunter Ischämie-/Reperfusionsschäden am Herzen (Lin et al., 2012; Zhang et al., 2015), IBD (Cheng et al., 2015) und Atherosklerose (Cheng et al., 2015).

Mikrobielle Produktinhibitoren von MLCK

K-252a, ein mikrobielles Alkaloid, das aus mikrobiellen Kulturen gereinigt wurde, ist ein nicht-selektiver Inhibitor von MLCK (Nakanishi et al., 1992) sowie anderer Proteinkinasen, einschließlich Proteinkinase C und einiger zyklischer nukleotidabhängiger Proteinkinasen (Nakanishi et al., 1992). KT592 ist ein Derivat von K-252a mit erhöhter Selektivität. Wortmannin, isoliert und gereinigt aus dem Pilzstamm Talaromyces wortmannin KY12420, ist ein weiteres mikrobielles Produkt, das MLCK hemmt (Nakanishi et al., 1992). Es hat sich gezeigt, dass es die sekretorischen Reaktionen in medullären Nebennierenzellen von Ratten durch Hemmung von MLCK verringert (Warashina, 2000) und eine antimykotische, hämorrhagische und entzündungshemmende Wirkung hat, die möglicherweise nicht mit der Hemmung von MLCK zusammenhängt (Nakanishi et al., 1992). Die potenziellen pharmakologischen Wirkungen dieser Inhibitoren müssen weiter untersucht werden.

Natürlich vorkommende potenzielle Inhibitoren von MLCK

Wie in Tabelle 2 dargestellt, können einige natürlich vorkommende bioaktive Bestandteile Inhibitoren von MLCK sein. In einem In-vitro-System mit gereinigtem Myosin und MLCK hemmte Quercetin die Myosinphosphorylierung. Diese Hemmung kann durch den MLCK-Inhibitor ML-7 blockiert werden, was darauf hindeutet, dass Quercetin ein direkter MLCK-Inhibitor sein könnte (Zhang et al., 2006). In einem Tiermodell für Darmmotilitätsstörungen führte die Verabreichung von Capsaicin zu einer deutlichen Verringerung der MLCK-Expression, was ebenfalls darauf hindeutet, dass MLCK ein Ziel für die Hemmung durch Capsaicin ist (Chen et al., 2015). Die Hemmung als Reaktion auf Salvianolsäure B könnte indirekt sein; andere Signalwege sind beteiligt. Salvianolsäure B verringert die MLCK-Expression durch Hochregulierung von microRNA1 (Xiong et al., 2016). Die Hochregulierung von microRNA-374a, microRNA-155, miR-520c-3p und miR-1290 hat ebenfalls die MLCK-Expression in verschiedenen Geweben verringert (Adyshev et al., 2013; Weber et al., 2014). Natürlich vorkommende bioaktive Verbindungen, die indirekt über microRNAs wirken, sind ein alternativer Hemmungsweg. Es sind jedoch krankheitsspezifische pharmakologische Experimente erforderlich, um die Wirkungen potenzieller natürlich vorkommender MLCK-Inhibitoren zu bestätigen.

Zusammenfassung

Dieser Überblick fasst die Beweise für eine Rolle von MLCK bei entzündlichen Erkrankungen, insbesondere IBD, zusammen. Eine abnorme Expression von MLCK ist an verschiedenen pathologischen Ereignissen beteiligt, vor allem durch Veränderungen des Zytoskeletts, die die epitheliale Barrierefunktion stören. Die Wirkung von Anti-MLCK-Wirkstoffen bei spezifischen Entzündungskrankheiten hängt davon ab, inwieweit die Endothelfunktion betroffen ist. Da MLCK in vielen Geweben reichlich exprimiert wird, ist die Vermeidung von behandlungsbedingten Nebenwirkungen ein wichtiger Aspekt. Die Berücksichtigung zweier Selektivitätsaspekte hilft dabei, Nebenwirkungen von MLCK-Inhibitoren vorherzusehen und zu vermeiden. Der erste ist die selektive Hemmung von MLCK und anderen Proteinkinasen wie der Proteinkinase C und der zyklischen nukleotidabhängigen Proteinkinase; der zweite ist die selektive Hemmung der verschiedenen MLCK-Isoformen wie smMLCK und nmMLCK. Potenzielle pharmazeutische Wirkstoffe gegen MLCK bieten einen neuen Einblick in die Behandlung von Entzündungskrankheiten, der sich von der herkömmlichen entzündungshemmenden Therapie unterscheidet.

Beiträge der Autoren

Konzeption und Gestaltung der Studie: DC. Überprüfung der Referenzen: DC, YX, CW, LW, ZZ, und LS. Entwurf der Arbeit und kritische Überarbeitung für wichtige intellektuelle Inhalte: DC, YX, CW, LW, ZZ und LS. Das Manuskript wurde von allen Autoren genehmigt.

Erklärung zu Interessenkonflikten

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne jegliche kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagung

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschussnummer 81600440, 81273919) und der Dalian Municipal Medical Research Foundation unterstützt.

Ergänzendes Material

Das ergänzende Material zu diesem Artikel finden Sie online unter: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00292/full#supplementary-material

Abbildung S1 | Die Mechanismen, die der MLCK-induzierten Regulation der endothelialen Barrierefunktion zugrunde liegen, sind dargestellt. Durchgehende Pfeile zeigen direkte Interaktionen an, gepunktete Pfeile zeigen indirekte Interaktionen an.

Adyshev, D. M., Moldobaeva, N., Mapes, B., Elangovan, V., and Garcia, J. G. (2013). MicroRNA-Regulierung der Expression der nicht-muskulären Myosin-Leichtketten-Kinase im menschlichen Lungenendothel. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 49, 58-66. doi: 10.1165/rcmb.2012-0397OC