Fluoreszierende Protein-Tags

Einführung

Fluoreszierende Proteine (FP) werden seit Mitte der 1990er Jahre als Protein-Tags hauptsächlich in der Zellbiologie und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Diese Markierungen haben nicht nur die Zellbiologie revolutioniert, indem sie die Darstellung fast aller Proteine ermöglichen, sondern sie werden auch in biochemischen Anwendungen eingesetzt. Ein wichtiges Beispiel ist die Immunpräzipitation und Affinitätsreinigung von FP-markierten Proteinen, die durch die Entwicklung von Affinitätsharzen mit hoher Ausbeute, Reinheit und Affinität wie den Nano-Traps von ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/) ermöglicht wurde.

In diesem Blog geben wir einen Überblick über

• grün fluoreszierende Proteine
• rot fluoreszierende Proteine
• selbstmarkierende Proteine, die die kovalente Kopplung eines fluoreszierenden Moleküls erfordern

Typen fluoreszierender Proteine

Die meisten Forscher verwenden intrinsisch fluoreszierende Proteine GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP oder mCherry. Alternativ dazu wurden extrinsisch fluoreszierende oder selbstmarkierende Proteine eingeführt, die die kovalente Kopplung eines fluoreszierenden Moleküls an das nicht fluoreszierende Protein erfordern, z. B. die Protein-Tags SNAP, CLIP und Halo. Diese selbstmarkierenden fluoreszierenden Proteine haben aufgrund der Eigenschaften ihrer Fluoreszenzfarbstoffe bestimmte Leistungsvorteile gegenüber intrinsischen FPs.

Abbildung 1: Strukturen fluoreszierender Proteine.

(A) Intrinsisch fluoreszierende Proteine (FPs) wie EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP usw. haben nur wenige gemeinsame Reste, falten sich aber alle zu einer konservierten β-Tonnenstruktur. Ihre Fluoreszenz entsteht durch die Zyklisierung des Rückgrats und die Oxidation von drei Aminosäureresten in der Mitte dieses Fasses (rechts hervorgehoben), was zu einem Chromophor mit zwei Ringen führt. Dieser chemische Prozess wird als Reifung des Chromophors bezeichnet, ist der Proteinfaltung inhärent und hängt nur von Umgebungsvariablen wie Temperatur und Sauerstoffkonzentration, nicht aber von zusätzlichen Enzymen ab. Farbe, Photostabilität, Quantenausbeute und andere spektrale Eigenschaften von intrinsisch fluoreszierenden Proteinen sind das Ergebnis von Mutationen innerhalb der Aminosäuren, die das Chromophor bilden oder sich in der Nähe des Chromophors befinden.

(B) Extrinsisch fluoreszierende Proteine wie HaloTag sind in ihrer basalen Apo-Form nicht fluoreszierend. Nur wenn dem HaloTag-Protein ein geeignetes aktiviertes Fluorophor hinzugefügt wird, wird dieses Fluorophor eingefangen und kovalent an den HaloTag-Rest D106 gebunden, wodurch HaloTag fluoreszierend wird. (PDB-IDs für Strukturen: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Das grün fluoreszierende Protein (GFP) der Qualle und seine Derivate sind immer noch die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Proteine in der biomedizinischen Forschung. Kürzlich wurden weitere grün fluoreszierende Proteine eingeführt, die von anderen Organismen stammen. Diese FP besitzen die gleiche Grundstruktur wie GFP, unterscheiden sich aber auf Sequenzebene erheblich. Daher erfordern sie neue, spezielle Forschungsinstrumente wie Antikörper.

Das Original: GFP

Green Fluorescent Protein wurde erstmals 1962 von Osamu Shimomura aus der Qualle Aequorea victoria isoliert. Es hat eine grüne Fluoreszenz mit langer Stokes-Verschiebung (ex 395nm; em 509 nm). 30 Jahre später gelang es Douglas Prasher, die Sequenz von GFP zu klonen, und Martin Chalfie exprimierte diese Sequenz in vivo. Später entwickelte das Labor von Roger Tsien GFP zu einer Reihe von veritablen Forschungsinstrumenten. Shimomura, Chalfie und Tsien wurden 2008 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Sehen Sie hier die Nobelpreisvorlesung von Roger Tsien: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Wissenschaftler entwickelten eine Fülle von GFP-Varianten mit unterschiedlichen Eigenschaften. Diese FPs haben unterschiedliche funktionelle und spektrale Eigenschaften. Die erste bedeutende Verbesserung von GFP war eine Mutation (S65T), die die Intensität und Stabilität des Fluoreszenzsignals erhöhte. Der Hauptanregungspeak wurde auf 488 nm verschoben (Heim et al., 1995). Die gebräuchliche Variante EGFP ist eine veränderte Version von GFP, die die praktische Verwendung von GFP in einer Vielzahl verschiedener Organismen und Zellen erleichtert.

Green Fluorescent Protein GFP ist auch als avGFP, wtGFP und gfp10 bekannt; EGFP als enhanced GFP und GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

Das 2004 vorgestellte TurboGFP ist ein schnell reifendes und helles dimeres grün fluoreszierendes Protein, das von CopGFP aus dem Copepoden Pontellina plumata abgeleitet ist. Das TurboGFP der Copepoden ist evolutionär weit von den aus Quallen stammenden fluoreszierenden Proteinen wie EGFP entfernt und weist nur etwa 20 % Sequenzidentität mit den häufig verwendeten GFP-Varianten auf. Daher binden die meisten Anti-GFP-Antikörper, einschließlich des in GFP-Trap verwendeten GFP-Nanobody, nicht an TurboGFP.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen stammt von einem multimeren gelben Fluoreszenzprotein der Lanzette Branchiostoma lanceolatum. Daher ist mNeonGreen evolutionär weit von den aus Quallen stammenden FPs entfernt. mNeonGreen und gewöhnliche GFP-Derivate haben nur etwa 20 % Sequenzidentität. Aufgrund der geringen Sequenzähnlichkeit ist zu erwarten, dass Affinitätstools (d. h. Antikörper) für GFP-Varianten nicht an mNeonGreen binden werden. Dies hat sich bei den Affinitätsreagenzien von ChromoTek (Anti-GFP-Nanokörper/VHHs und Antikörper) gezeigt.

Das 2013 erstmals veröffentlichte mNeonGreen ist bis zu dreimal heller als GFP. Es ist ein aufstrebendes, monomeres, vielseitiges grün/gelb fluoreszierendes Protein für Bildgebungsanwendungen, einschließlich hochauflösender Mikroskopie. Darüber hinaus dient mNeonGreen als Akzeptor für cyanfarbene fluoreszierende Proteine in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Anwendungen (FRET). Es scheint das hellste bisher bekannte monomere grün fluoreszierende Protein zu sein und hat eine schnelle Reifungsrate.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Vergleich von GFP, TurboGFP, und mNeonGreen

Eigenschaft	EGFP (am häufigsten verwendetes GFP-Derivat)	turboGFP	mNeonGreen
Entdeckung/ Erstveröffentlichung
Herkunft	GFP von Qualle Aequorea victoria	CopGFP von Copepode Pontellina plumata	multimeres gelbes fluoreszierendes Protein aus Lanzettfischchen Branchiostoma lanceolatum
Reifungsrate (bei 37°C)	25 min	25 min	10 min
Sequenzidentität mit EGFP	(100%)	~20%	~20%
Abgeleitet von GFP?	Ja	Nein	Nein
Struktur	Schwach Dimer	Dimer	Monomer
Gängige Varianten	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeres eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Anregungs/Emissionsmaximum	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
Länge/ Molekulargewicht (MW)	239 Aminosäuren, 26.9 kDa	2x 232 Aminosäuren, 2x 26 kDa	237 Aminosäuren, 26,6 kDa
Forschungswerkzeuge von ChromoTek	Immunopräzipitation: GFP-Trap Immunofluoreszenz: GFP-Booster, Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper PABG1 Western Blot: Ratte anti-GFP-Antikörper Kontrolle: gereinigtes EGFP-Protein	Immunpräzipitation: TurboGFP-Falle	Immunopräzipitation: mNeonGreen-Falle Immunofluoreszenz: Maus-anti-mNeonGreen-Antikörper Westernblot: Mouse anti-mNeonGreen antibody

Rot fluoreszierende Proteine (RFP) sind FP, die rot-oranges Fluoreszenzlicht aussenden. Das erste RFP, das auf dem Markt erhältlich war, war DsRed. Es wurde 1999 aus Discosoma sp. Seeanemonen gewonnen.

DsRed hat einige immanente praktische Probleme: (i) Es hat eine Reifungszeit von etwa 24 Stunden, was es für Kurzzeitexperimente unbrauchbar macht. (ii) Die tetramerische Form von DsRed kann die Funktion der Proteine, an die es gebunden ist, beeinträchtigen. (iii) Seine Photostabilität ist eher gering.

Infolgedessen wurde DsRed einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um als genetisch kodierter Fusionsmarker allgemein einsetzbar zu werden. Schließlich wurden monomere RFP-Derivate mit besserer Fluoreszenzleistung (in Bezug auf Helligkeit und Photostabilität) und höherer Reifungseffizienz hergestellt. Darüber hinaus wurden Derivate mit orangefarbener, roter und weit roter Fluoreszenz entwickelt. Diese monomerisierten Versionen von RFP wurden zu den wertvollen Forschungsinstrumenten mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (auch bekannt als „mFruits“), mKO, mRFP (auch bekannt als. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2 und DsRed-Express usw.

Weitere RFPs wurden in anderen Anthozoen (z.B. Anemonen und Korallen) identifiziert, aber auch diese Proteine waren meist Tetramere. Daher wurden sie für den Einsatz in der Forschung noch nicht weiter optimiert.

mRFP (auch bekannt als mRFP1)

Die erste monomere Variante von dsRed, die im Labor von Roger Tsien gentechnisch hergestellt wurde, wurde einfach als mRFP (oder mRFP1) bezeichnet, d. h. als monomeres rot fluoreszierendes Protein. Im Vergleich zu dsRed zeichnet sich mRFP1 durch eine etwas geringere Absorption, Quantenausbeute und Photostabilität aus. Seine Reifungsrate ist jedoch etwa 10 Mal schneller als die von DsRed, was zu einer ähnlichen effektiven Helligkeit führt, wenn es in lebenden Zellen exprimiert wird.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry ist wahrscheinlich die am häufigsten verwendete RFP-Variante. Es ist ein monomeres rot fluoreszierendes Protein mit breiter Anwendbarkeit als Fusionsprotein in verschiedenen Zelltypen. Wie andere mFruit-RFPs wurde mCherry von der dsRed-Variante mRFP1 durch gezielte Evolution im Labor von Roger Tsien abgeleitet. Im Vergleich zu anderen mFruits hat mCherry die höchste Photostabilität, die schnellste Reifungsrate und eine ausgezeichnete pH-Beständigkeit. Es hat jedoch eine geringere Quantenausbeute als mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Roger Tsiens Labor hat auch ein weit rotes monomeres Derivat von mRFP1/dsRed mit dem Namen mPlum entwickelt. Fernrot-RFPs sind für Ganzkörper-Bildgebungsanwendungen von Vorteil, da die wichtigsten Gewebeabsorber wie Wasser, Lipide und Hämoglobin im Emissionsbereich von 650-900 nm nahezu transparent sind. Wie die meisten rotverschobenen RFPs weist auch mPlum eine erweiterte Stokes-Verschiebung auf.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Vergleich von mCherry, mRFP (mRFP1), und mPlum

Eigenschaft	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Entdeckung/ erste Veröffentlichung
Ursprung	DsRed aus Seeanemone Discosoma sp.	DsRot von Seeanemone Discosoma sp.	DsRot von Seeanemone Discosoma sp.
Reifungsrate (bei 37°C)	15 min	60 min	100 min
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer
Aggregation	nein	nein	nein
Anregungs-/Emissionsmaximum	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Länge/ Molekulargewicht (MW)	236 Aminosäuren, 26.7 kDa	228 Aminosäuren, 25.4 kDa	229 Aminosäuren, 25.6 kDa
Forschungswerkzeuge von ChromoTek	Immunopräzipitation: RFP-Trap Immunofluoreszenz: RFP-Booster, Ratte anti-RFP-Antikörper Western Blotting: Maus anti-RFP Antikörper	Immunopräzipitation: RFP-Trap Immunofluoreszenz: RFP-Booster, Ratte anti-RFP-Antikörper Western Blotting: Maus anti-RFP Antikörper	Immunopräzipitation: RFP-Trap Immunofluoreszenz: RFP-Booster, Ratte anti-RFP-Antikörper Western Blotting: Maus-Anti-RFP-Antikörper

Die extrinsisch fluoreszierenden Protein-Tags Halo, SNAP und CLIP erfordern den kovalenten Einfang eines kleinen fluoreszierenden Liganden, um sich in ein fluoreszierendes Protein zu verwandeln. Zu diesem Zweck werden diese selbstmarkierenden Protein-Tags von Enzymen abgeleitet, die die Bildung von chemischen Bindungen katalysieren: Die SNAP- und CLIP-Tags sind Varianten der O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase, die mit Benzylguanin- bzw. Benzylcytosin-Derivaten reagieren. Der HaloTag ist von einer Halogenalkandehalogenase abgeleitet und reagiert mit Alkylhalogeniden (Abbildung 1).

Im Allgemeinen werden sowohl intrinsisch als auch extrinsisch fluoreszierende Proteine an ein Protein von Interesse fusioniert, um dessen zelluläre Darstellung und Erkennung zu ermöglichen. Extrinsisch fluoreszierende Proteine erfordern jedoch den Zusatz eines reaktiven Fluorophors, was mehrere Vorteile hat:

• Höhere Quantenausbeute und Photostabilität
• Starke Fluoreszenz sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen
• Eine breitere Auswahl an Fluoreszenzfarbstoffen
• Ein einziges genetisches Konstrukt ermöglicht die Auswahl verschiedener Fluorophore für Multicolor Bildgebung/Multiplexing
• Fluoreszenz wird erst nach Zugabe der Markierung ausgelöst

Die Verfügbarkeit von drei extrinsisch fluoreszierenden Proteinen mit unterschiedlichen Substrat/Ligand-Spezifitäten ermöglicht deren orthogonale Verwendung in Multiplex-Experimenten, auch in Kombination mit intrinsischen FPs.

Abhängig von den experimentellen Anforderungen können zellpermeable Liganden auf der Basis von Tetramethylrhodamin (TMR), Oregon Green, diAcFAM oder Cumarin verwendet werden, die die Zellmembran zur Markierung intrazellulärer Proteine leicht durchdringen. Alternativ können zellundurchlässige Liganden auf der Basis von undurchlässigen Fluorophoren wie Alexa Fluor® 488 und 660 für die schnelle Markierung der Zelloberfläche verwendet werden.

Vergleich von HaloTag, SNAP-Tag, und CLIP-Tag

Eigenschaft	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Entdeckung/Erstveröffentlichung
Herkunft	Haloalkan-Dehalogenase aus Rhodococcus rhodochrous	Human O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase	Human O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer
Reaktivität	Chloralkanderivate	O6-Benzylguanin-Derivate	Benzylcytosin-Derivate
Liganden	Zellpermeable oder nicht-permeable Farbstoffe, Fluorophore, Biotin und Perlen	Zellpermeable oder nicht-permeable Farbstoffe, Fluorophore, Biotin und Perlen	Zellpermeable oder nicht-permeable Farbstoffe, Fluorophore, Biotin, und Beads
Anregungs-/Emissionsmaximum	Abhängig vom gekoppelten Fluorophor	Abhängig vom gekoppelten Fluorophor	Abhängig vom gekoppelten Fluorophor
Länge/Molekulargewicht (MW)	297 Aminosäuren, 33.6 kDa	182 Aminosäuren, 19.4 kDa	182 Aminosäuren, 19.4 kDa
Forschungswerkzeuge von ChromoTek	Immunopräzipitation: Halo-Trap Western Blotting: Maus anti-HaloTag Antikörper	Immunpräzipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western Blotting: Ratte anti-SNAP/CLIP-tag®-Antikörper	Immunopräzipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western Blotting: Ratte anti-SNAP/CLIP-tag®-Antikörper

HaloTag

Der selbstmarkierende HaloTag wurde von dem Haloalkan-Dehalogenase-Enzym DhaA aus Rhodococcus rhodochrous abgeleitet. Sein aktives Zentrum wurde genetisch so verändert, dass es Chloralkan-Linkersubstrate irreversibel bindet. Durch diese Art der Selbstmordhemmung ist eine Regeneration seiner katalytischen Stelle für weitere Dehalogenierungen nicht mehr möglich. Je nach gewähltem Substrat wird der HaloTag in ein fluoreszierendes Protein umgewandelt oder kann z. B. auf Agarosekügelchen immobilisiert werden.

Da Haloalkandehalogenasen in eukaryotischen Zellen und den meisten Prokaryoten, einschließlich E. coli, gibt es keine Hintergrundmarkierung.

SNAP-Tag

Das selbstmarkierende Protein-Tag SNAP-Tag ist von der menschlichen O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (hATG) abgeleitet, die als Wildtyp-Protein Alkylierungsschäden von der DNA entfernt. Die resultierende hAGT-Variante, die als SNAP-Tag verwendet wird, reagiert kovalent mit O6-Benzylguanin-Derivaten (d. h. einem fluoreszierenden Marker, der über einen Benzyl-Linker an Guanin- oder Chlorpyrimidin-Abgangsgruppen konjugiert ist) in einer irreversiblen und hochspezifischen Weise. Bei der Markierungsreaktion wird die substituierte Benzylgruppe des Substrats kovalent an den SNAP-tag gebunden.

CLIP-tag

CLIP-tag ist eine modifizierte Version von SNAP-tag, die so konstruiert wurde, dass sie mit Benzylcytosin- statt mit Benzylguaninderivaten reagiert. In Verbindung mit SNAP-tag ermöglicht CLIP-tag die orthogonale und komplementäre Markierung von zwei Proteinen gleichzeitig in derselben Zelle.

Ein Leitfaden zur Auswahl fluoreszierender Proteine
Shaner N.C., Steinbach P.A. und Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Grün fluoreszierende Proteine:
Das grün fluoreszierende Protein
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Verbesserte grüne Fluoreszenz
Heim, R., Cubitt A.B. und Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Strukturelle Grundlage für die schnelle Reifung des grün fluoreszierenden Proteins von Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A und Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Ein helles monomeres grün fluoreszierendes Protein aus Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. und Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Rot fluoreszierende Proteine:

Verbesserte monomere rot, orange und gelb fluoreszierende Proteine, abgeleitet von Discosoma sp. rot fluoreszierendem Protein
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. und Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Ein monomeres rot fluoreszierendes Protein
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. und Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evolution von neuen Nicht-Antikörper-Proteinen durch iterative somatische Hypermutation
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. und Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. and Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.

Halo, SNAP, and CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. and Johnsson K. (2008)
Chemie und Biologie 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. und Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

Eine allgemeine Methode zur kovalenten Markierung von Fusionsproteinen mit kleinen Molekülen in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. und Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

Nur für Forschungszwecke.

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