Erhöhte 1-α-Hydroxylase-Aktivität in Monozyten von Patienten mit aktiver Tuberkulose

Abstract

Ein urämischer Patient entwickelte nach einer Tuberkulose-Infektion eine Hyperkalzämie, und seine ionisierten Kalziumwerte korrelierten mit den 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3)-Werten. Wir führten weitere Studien durch, um festzustellen, ob Monozyten neben den Nierentubuluszellen alternative Orte der 1,25(OH)2D3-Umwandlung sind. Mit Hilfe eines Ex-vivo-Bioassays fanden wir in dieser Studie heraus, dass die Aktivität der 1-α-Hydroxylase (CYP27B1) in Monozyten bei Patienten mit aktiver Tuberkulose (TB) deutlich höher ist als bei Patienten mit häufigem TB-Kontakt. Wenn jedoch Monozyten von Patienten mit aktiver TB mit Antigen aus Mycobacterium tuberculosis restimuliert wurden, wurde weniger 1,25(OH)2D3 beobachtet. Im Gegensatz dazu war der 1,25(OH)2D3-Spiegel bei Personen mit häufigem TB-Kontakt unverändert. Wir schließen daraus, dass Monozyten eine alternative Quelle für 1-α-Hydroxylase sein könnten, die 25-Hydroxyvitamin D3 in das aktivere 1,25(OH)2D3 umwandeln könnte.

1. Einleitung

Tuberkulose hat die Welt seit prähistorischen Zeiten geplagt. Einem aktuellen Bericht zufolge erliegen jährlich eine Million Patienten der Tuberkulose und den damit verbundenen Begleiterkrankungen. In den letzten Jahrzehnten wurden enorme Anstrengungen unternommen, um den pathophysiologischen Prozess der Krankheit zu verstehen. Tiermodelle und Studien am Menschen haben den Weg zur Klärung der individuellen Immunreaktionen auf Mycobacterium tuberculosis (MTB) geebnet. Diese Studien belegen, dass Vitamin D eine wichtige Rolle bei der Resistenz des Menschen gegen Tuberkulose spielt. Vitamin D wird seit mehr als 200 Jahren zur Bekämpfung der Tuberkulose eingesetzt. Lebertran und Calciferol, wichtige Vitamin-D-Quellen, werden seit dem 17. Jahrhundert zur Behandlung von Tuberkulosepatienten eingesetzt. In der normalen Physiologie wird nach der Sonneneinstrahlung das in der Haut gespeicherte 7-Dehydrocholesterin in Prävitamin D3 umgewandelt, gefolgt von einer thermischen Isomerisierung zu Vitamin D3 . Anschließend wird das Vitamin D3 in der Leber zu 25-Hydroxyvitamin D3 (25(OH)D3) hydroxyliert. Anschließend wird 25(OH)D3 durch 1-Hydroxylase (CYP27B1) weiter zur aktivsten Form von Vitamin D3, 1,25(OH)2D3, hydroxyliert. Nierentubuläre Epithelzellen sind eine wichtige Quelle für 1-Hydroxylase und spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Konzentration von 1,25(OH)2D3 im Serum. Das Vorhandensein von CYP27B1 in extrarenalen Geweben ist bereits seit Jahrzehnten bekannt. Der Einfluss von CYP27B1 in extrarenalen Geweben auf die Serumkonzentration von 1,25(OH)2D3 muss noch ermittelt werden.

Wir trafen auf einen 34-jährigen Patienten mit Urämie, der seit 2 Jahren regelmäßig eine Hämodialyse erhielt. Der Patient litt 2 Tage lang unter Muskelschwäche und Müdigkeit, bevor er einen Hausarzt aufsuchte. In der Blutchemie wurde ein erhöhter Wert an ionisiertem Kalzium (5,44 mg/dL) festgestellt. Trotz der Hyperkalzämie wurden die Symptome des Patienten durch eine konventionelle Behandlung gelindert. Vier Monate später erlitt der Patient eine zunehmende Muskelschwäche, die von Fieber begleitet wurde. In der Notaufnahme wurde erneut ein erhöhter Wert an ionisiertem Kalzium festgestellt (6,88 mg/dL). Außerdem zeigte ein EKG einen abnormalen Herzrhythmus und ein kurzes QT-Intervall mit verbreiterter T-Welle. Eine Röntgenaufnahme des Brustkorbs zeigte eine Lungeninfiltration im rechten Oberlappen, die sich später als Lungentuberkulose herausstellte. Der Patient erhielt daraufhin eine 9-monatige antituberkulöse Behandlung. Vier Monate nach der Behandlung normalisierte sich der ionisierte Kalziumspiegel des Patienten (5,2 mg/dL), und die Symptome verschwanden vollständig. Um die Pathogenese der Hyperkalzämie dieses Patienten zu klären, haben wir zusätzlich zu den ionisierten Kalziumspiegeln auch die 1,25(OH)2D3-Spiegel gemessen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, korrelierten die 1,25(OH)2D3-Konzentrationen stark mit denen des ionisierten Kalziums.

Abbildung 1

Veränderungen der Konzentrationen von ionisiertem Kalzium und 1,25(OH)2D3 im Serum eines Patienten mit aktiver TB und Urämie.

Neben der renalen CYP27B1-Expression gelten Makrophagen und Monozyten als wichtige extrarenale Orte der CYP27B1-Expression. In dieser Studie untersuchten wir die Rolle von Monozyten beim Metabolismus von Vitamin D3 mithilfe eines Ex-vivo-Bioassays. Außerdem stimulierten wir Monozyten mit MTB-Antigen, um weitere Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie Monozyten den Vitamin-D3-Stoffwechsel als Reaktion auf eine bakterielle Herausforderung modulieren.

2. Materialien und Methoden

2.1. Probandenpopulation

Diese Studie wurde an der Kaohsiung Medical University durchgeführt. Die Teilnehmer wurden in zwei Gruppen eingeteilt: (1) aktive TB und (2) häufiger TB-Kontakt. Personen mit aktiver Lungentuberkulose, die durch eine Sputumkultur und eine Thoraxaufnahme bestätigt wurde, wurden der Gruppe der aktiven Tb zugeordnet (). Zu den häufigen TB-Kontakten () gehörten die folgenden Personen: (1) medizinisches Personal, das seit mindestens 10 Jahren im TB-Zentrum arbeitete und nie infiziert worden war, und (2) Familienangehörige von TB-Patienten, Klinikpersonal und Krankenschwestern, die seit langem Kontakt zu TB-Patienten hatten und nie infiziert worden waren. Alle häufigen TB-Kontakte waren mit BCG geimpft worden und unterzogen sich einer jährlichen Röntgenuntersuchung der Brust; wenn die Röntgenaufnahmen abnormal waren, wurde ein Mantoux-Test durchgeführt. Wir schlossen Personen mit Diabetes, bösartigen Erkrankungen oder anderen Krankheiten, die eine Immunschwäche verursachen könnten, aus. Die beiden Gruppen waren in Geschlecht und Alter identisch (Tabelle 1).

2.2. Zellpräparation

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus mit Heparin behandeltem Blut der beiden Spendergruppen unter Verwendung eines Standard-Ficoll-Paque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) isoliert. Die PBMCs (Zellen/ml) wurden in RPMI 1640-Medium resuspendiert, das mit L-Glutamin und 10 % fetalem Kälberserum ergänzt war. Nach einstündiger Inkubation in einem 75-cm2-Kolben in einem befeuchteten 37°C-, 5%-CO2-Inkubator wurde das Medium mit den nicht-adhärenten Zellen in ein konisches Röhrchen umgefüllt, und der Kolben wurde zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen, um alle restlichen nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. Adhärente Monozyten wurden durch vorsichtiges Abschaben mit einem Zellschaber aus Kunststoff entfernt. Die Zellen wurden in ein konisches Röhrchen überführt, zentrifugiert, um die Waschlösung zu entfernen, und in ergänztem Medium auf Zellen/ml resuspendiert. Die adhärente Zellpopulation enthielt mehr als 85 % CD14+-Zellen.

2.3. Antigen

MTB, die von Patienten mit Tuberkulose isoliert wurden, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und im Wasserbad bei 70°C 70 Minuten lang hitzegetötet. Anschließend wurden die Bakterien mit einem New Highway-Sonicator (Farmingdale, NY, USA) beschallt. Die Proteinkonzentration des bakteriellen Homogenats wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (IL, USA) bestimmt und bei -20°C gelagert.

2.4. Zytofluorometrische Analyse

Die zytometrische Analyse wurde mit einem FACS Zytometer (Becton Dickinson) durchgeführt. Alle Zellen wurden mit jedem monoklonalen Antikörper in sättigenden Mengen in 50 μl Färbepuffer (Hank’s balanced salt solution: 1% BSA und 0,1% Natriumazid) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden für die Analyse vorbereitet, indem sie in 500 μl 1% Paraformaldehyd in PBS suspendiert wurden. Die Monozytenpopulation wurde für die Analyse auf der Grundlage eines Punktdiagramms mit Seiten- und Vorwärtsstreuung ausgewählt. Für jede Analyse wurden insgesamt 5.000 gated Zellen verwendet. Die gated Zellen wurden durch Fluoreszenzfärbung mit Fluorescein-Isothiocyanat- (FITC-) konjugiertem Anti-CD14 (Ancell) weiter analysiert.

2.5. Quantifizierung von 1,25(OH)2D3

Gereinigte Monozyten wurden mit einer Dichte von Zellen/mL in 100 μL in jeder Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit 200 nM 25(OH)D3, gelöst in einer Endkonzentration von 1% Ethanol, kultiviert. Nach 3 Stunden Inkubation wurde 1 mL Acetonitril zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Zellen und das Medium wurden geerntet und mit einem gleichen Volumen Methanol versetzt, um die Lipide zu entfernen. Die Menge an 1,25(OH)2D3 wurde mit dem 1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA-Kit (INCSTAR, Stillwater, MN, USA) bestimmt. Kurz gesagt, wurden 2 mL Wasser und 5 mL Methanol/Wasser (70 : 30) in eine C18OH-Kartusche gegeben, um Salze, polare Lipide und Pigmente unter Vakuum zu entfernen. Anschließend wurden 5 mL Hexan/Methylenchlorid (90 : 10) in die C18OH-Kartusche gegeben, um 25(OH)D3 zu entfernen, und 5 mL Hexan/Isopropanol (99 : 1), um 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3 zu entfernen. Jede C18OH-Kartusche wurde fest in eine Silika-Kartusche eingesetzt. Nach Zugabe von Hexan/Isopropanol (92 : 8) unter Vakuum wurde die C18OH-Kartusche entfernt. Schließlich wurde das gereinigte 1,25(OH)2D3 aus der Kieselgelkartusche in 5 mL Hexan/Isopropanol (80 : 20) eluiert. Der Gehalt an 1,25(OH)2D3 wurde durch einen kompetitiven Radioimmunoassay (RIA) unter Verwendung von 125I-markierten Anti-1,25(OH)2D3- und Anti-1,25(OH)2D3-Antikörpern quantifiziert.

2.6. Behandlung mit MTB-Antigenen

Monozyten (Zellen/ml) wurden mit 10 μg/ml MTB und 200 ng/ml 25(OH)D3 inkubiert. Nach 3 Stunden Inkubation wurde 1 mL Acetonitril hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das resultierende 1,25(OH)2D3 wurde aus den Zellen und dem Medium gereinigt und mittels RIA quantifiziert. Das restliche Verfahren war dasselbe wie beim vorherigen Assay.

2.7. Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit Hilfe des Student’s -Tests analysiert.

3. Ergebnisse

3.1. Ionisiertes Kalzium und 1,25 Dihydroxyvitamin D3-Konzentrationen bei einem Patienten mit aktiver TB und Urämie

Ionisiertes Kalzium und 1,25(OH)2D3 im Serum wurden zu verschiedenen Zeitpunkten vom ersten Besuch bis ein Jahr nach Abschluss der antituberkulösen Behandlung bestimmt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, korrelierten die Werte von ionisiertem Kalzium mit der Konzentration von 1,25(OH)2D3 (Abbildung 1).

3.2. Studienpopulation

Fünfundzwanzig Personen wurden in die Gruppe der häufigen TB-Kontakte und 25 Patienten in die Gruppe der aktiven TB rekrutiert. Das Durchschnittsalter und das Geschlechterverhältnis unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen. Die Merkmale des Datensatzes sind in Tabelle 1 dargestellt.

3.3. 1,25(OH)2D3-Quantifizierung

Monozyten wurden 3 Stunden lang mit 25(OH)D3 kultiviert. Anschließend wurde 1,25(OH)2D3 aus den Zellen und dem Medium gereinigt und mittels RIA gemessen. Wie in Abbildung 2 dargestellt, lag die Menge an 1,25(OH)2D3 in der aktiven TB-Gruppe bei pg/ml (Mittelwert ± SD), was signifikant höher war als in der Gruppe mit häufigem TB-Kontakt () (). Wenn Monozyten gleichzeitig mit MTB und 25(OH)D3 für 3 Stunden inkubiert wurden, nahm die Menge an 1,25(OH)2D3 in der aktiven TB-Gruppe im Vergleich zu der Gruppe ohne MTB ( bzw. ,) signifikant ab () (siehe Abbildung 3). Es gab keinen Unterschied zwischen Monozyten mit oder ohne Exposition gegenüber MTB in der Gruppe mit häufigem TB-Kontakt ( und , bzw. ).

Abbildung 2

Quantifizierung von 1,25(OH)2D3 bei Patienten mit aktiver TB und häufigen TB-Kontakten. RIA-Messung von 1,25(OH)2D3, gereinigt aus Monozytensuspensionen, die 3 Stunden lang mit 25(OH)D3 kultiviert wurden. Die Menge an 1,25(OH)2D3 war in der Gruppe mit aktiver TB signifikant höher als in der Gruppe mit häufigen TB-Kontakten. Jede Spalte stellt den Mittelwert der 1,25(OH)2D3-Quantifizierung dar. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Abbildung 3

Quantifizierung von 1,25(OH)2D3 bei Patienten mit aktiver TB und häufigen TB-Kontakten mit oder ohne M. tuberculosis (MTB)-Antigen. Monozyten wurden mit 25(OH)D3 mit oder ohne MTB gepulst. Die Menge an 1,25(OH)2D3 mit MTB-Exposition nahm im Vergleich zu derjenigen ohne MTB in der aktiven TB-Gruppe signifikant ab. Jede Spalte stellt den Mittelwert der 1,25(OH)2D3-Quantifizierung dar. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

4. Diskussion

Wir beobachteten, dass der 1,25(OH)2D3-Spiegel mit dem ionisierten Kalziumspiegel bei einem urämischen Patienten mit Lungentuberkulose korrelierte. Bei aktiver Lungentuberkulose waren die Serumspiegel von 1,25(OH)2D3 bei diesem Patienten hoch, was wiederum hohe Werte an ionisiertem Kalzium zur Folge hatte. Nach der Behandlung sanken sowohl die 1,25(OH)2D3- als auch die ionisierten Kalziumwerte. Theoretisch ist die renale CYP27B1-Aktivität bei einem urämischen Patienten unbedeutend. Niedrige Serum-1,25(OH)2D3-Spiegel werden bei urämischen Patienten häufig beobachtet. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen beim Menschen werden auch in einem anephrischen Mausmodell niedrige 1,25(OH)2D3-Spiegel beobachtet. Eine extrarenale Quelle für CYP27B1 wird jedoch schon seit mehr als 6 Jahrzehnten beschrieben. Harrell und Fisher waren die ersten, die eine extrarenale Synthese von 1,25(OH)2D3 unter pathologischen Bedingungen nachwiesen. Diese Autoren stellten den Zusammenhang zwischen einer gestörten Kalziumhomöostase und Sarkoidose her. Später wurde gezeigt, dass die Makrophagen des Gewebes bei diesen Patientengruppen eine extrarenale Quelle der 1,25(OH)2D3-Produktion darstellen. In verschiedenen Studiengruppen wurde festgestellt, dass immer mehr Gewebe CYP27B1 exprimieren, z. B. Hautmelanozyten, Gewebemakrophagen und Restzellen der Plazenta. Überraschenderweise besitzt nicht jede Zelle, die CYP27B1 exprimiert, eine enzymatische Aktivität. Um zu klären, inwieweit zirkulierende Monozyten zu hohen 1,25(OH)2D3-Spiegeln beitragen, haben wir einen Ex-vivo-Bioassay mit 25(OH)D3 als Substrat durchgeführt, um die Aktivität von CYP27B1 zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die CYP27B1-Aktivität in Monozyten von Patienten mit aktiver TB deutlich höher ist als in Monozyten von Personen mit häufigem TB-Kontakt. Zirkulierende Monozyten tragen zur Umwandlung von 25(OH)D3 in das aktivere 1,25(OH)2D3 bei. Erstaunlicherweise wurde Vitamin D3 traditionell als endokriner Faktor betrachtet; 1,25(OH)2D3, das an lokalen Stellen (Nierentubuli) produziert wird, wird über das Blut in andere Gewebe oder Organe, z. B. die Knochen, transportiert. In den letzten Jahrzehnten wurde jedoch gezeigt, dass Vitamin D3 auch andere als endokrine Funktionen hat. Das von Entzündungszellen produzierte 1,25(OH)2D3 kann die Expression von Vitamin-D-Rezeptoren sowohl in benachbarten Zellen als auch in den Entzündungszellen selbst stimulieren. Durch Bindung an den Vitamin-D-Rezeptor und den Retinoidrezeptor kann der Liganden-Rezeptor-Komplex an die Promotoren zahlreicher Entzündungsgene binden. Aufgrund dieser Wirkungen wurde Vitamin D3 sowohl eine parakrine als auch eine autokrine Funktion zugeschrieben. Im Gegensatz zur endokrinen Funktion von Vitamin D3 als Kalziumregulator veranlassen seine parakrinen und autokrinen Funktionen die Entzündungszellen, antibakterielle Peptide zu produzieren und den Prozess der Autophagie zu verstärken. Da 1,25(OH)2D3 lokal produziert wird und nicht zu den Zielorten für die Regulierung der Kalziumhomöostase transportiert wird, wirkt sich seine Produktion nicht auf den Serumkalziumspiegel aus. Interessanterweise haben wir in dieser Studie festgestellt, dass das von Monozyten produzierte 1,25(OH)2D3 einen Sonderfall darstellt. Obwohl das von Monozyten produzierte 1,25(OH)2D3 lokal wirken kann, werden diese Zellen mit dem Blut zu den Geweben im ganzen Körper transportiert. Das von Monozyten produzierte 1,25(OH)2D3 verhält sich auch wie ein endokriner Faktor. Monozyten sind möglicherweise die einzigen Zellen in unserem Körper, die die endokrinen, parakrinen und autokrinen Funktionen von Vitamin D3 orchestrieren können. Eine interessante Frage ist, welchen relativen Beitrag die monozytäre Quelle von 1,25(OH)2D3 zum Gesamt-1,25(OH)2D3-Spiegel leistet. Dusso et al. stellten fest, dass die maximale Produktion von 1,25(OH)2D3 aus Monozyten im Vergleich zur 1,25(OH)2D3-Konzentration in normalen Zellen (in pmol/ml) trivial ist (in fmol/Stunde/Mikrogramm DNA). Die Daten stammen jedoch aus einem Ex-vivo-Experiment, und wir wissen nicht, wie viele Monozyten im Körper zur Produktion von 1,25(OH)2D3 angeregt werden. Wir vermuten, dass der relative Beitrag der monozytären Quelle von 1,25(OH)2D3 zum Gesamt-1,25(OH)2D3-Spiegel unter den meisten Umständen gering ist. Selbst bei Patienten mit granulomatöser Erkrankung haben nur wenige von ihnen klinische Symptome einer Hyperkalzämie, die auf einen hohen 1,25(OH)2D3-Spiegel zurückzuführen ist. Unser Indikatorfall ist einer von ihnen.

Wir fanden auch heraus, dass die Umwandlung von 1,25(OH)2D3 signifikant niedriger ist, wenn Monozyten von Patienten mit aktiver TB mit MTB-Antigen kultiviert werden, als wenn kein Antigen hinzugefügt wird. In der Gruppe der Patienten mit häufigem TB-Kontakt gab es keinen Unterschied zwischen der Behandlung mit und ohne MTB-Antigen. Für diese Beobachtung gibt es zwei mögliche Erklärungen. Erstens können geprimte Monozyten von Patienten mit aktiver TB mehr Aktivität der 24(OH)-Hydroxylase (CPY24) induzieren, die aktiv 1,25(OH)2D3 zu Calcitrosäure hydroxyliert, wenn sie weiter mit MTB-Antigen stimuliert werden. Vitamin D3 induziert nicht nur entzündliche Genprodukte, sondern auch die Expression von CPY24 . CPY24 ist ein wichtiges katabolisches Enzym von Vitamin D3. Die CYP27B1- und CYP24-Aktivitäten werden auf diametral entgegengesetzte Weise moduliert, um den Serumspiegel von 1,25(OH)2D3 zu kontrollieren. Aufgrund dieser konzertierten Aktion wird eine Hyperkalzämie bei den Patienten nur selten beobachtet. Die Gruppe mit häufigem Tuberkulosekontakt zeigte eine noch bessere konzertierte Aktion, weshalb sich die 1,25(OH)2D3-Konversion nach Stimulation mit MTB-Antigen nicht veränderte. Eine zweite Erklärung ist, dass die CPY27B1-Aktivität erschöpft ist, wenn Monozyten durch MTB-Antigen restimuliert werden.

Die mRNA-Expression wurde in dieser Studie aus folgenden Gründen nicht bestimmt. Erstens wurde für den Ex-vivo-Bioassay eine große Anzahl von Monozyten der Teilnehmer benötigt. Hätten wir sowohl die quantitative mRNA-Expression als auch den Ex-vivo-Bioassay durchgeführt, hätten wir von jedem Teilnehmer mehr als 30 ml Blut abnehmen müssen. Die Entnahme einer solchen Blutmenge wurde von unserer Ethikkommission abgelehnt. Zweitens können, wie bereits erwähnt, einige Gewebe CYP27B1 exprimieren, ohne dass eine enzymatische Aktivität nachweisbar ist. mRNA-Spiegel korrelieren nicht immer mit enzymatischer Aktivität. Obwohl CYP27B1 in einigen Geweben exprimiert wird, wurde keine enzymatische Aktivität nachgewiesen. In zukünftigen Studien sollten die Spiegel von CYP27B1 und CYP24 sowie die Metaboliten von Vitamin D3, wie Calcitrosäure und 24,25(OH)2D3, quantifiziert werden, um den Vitamin-D3-Stoffwechsel im pathophysiologischen Prozess der Tuberkulose zu klären.

5. Schlussfolgerung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Kalziumspiegel mit dem 1,25(OH)2D3-Spiegel bei einem urämischen Patienten, der mit Tuberkulose infiziert war, korrelierte. Außerdem stellten wir fest, dass die CYP27B1-Aktivität in Monozyten bei Patienten mit aktiver Tuberkulose höher ist als bei Patienten mit häufigem TB-Kontakt.

Ethische Genehmigung

Dieses Studienprojekt wurde vom Institutional Review Board des Kaohsiung Medical University Hospital genehmigt. Die Genehmigungsnummer lautet KMUH-IRB-20130103.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es für diese Arbeit keinen Interessenkonflikt gibt.

Beitrag der Autoren

Yi-Ching Tung und Wen-Chan Tsai haben die Experimente durchgeführt und die Arbeit geschrieben. Tsan-Teng Ou und Wen-Chan Tsai entwarfen die Studie und sammelten die Proben. Alle Autoren lasen und genehmigten die endgültige Fassung der Arbeit.