Eine kritische Rolle von CD29 und CD49f bei der Vermittlung der Metastasierung von krebsinitiierenden Zellen, die aus einem Brca1-assoziierten Mausmodell für Brustkrebs isoliert wurdenassoziierten Mausmodell für Brustkrebs

CSCs in Brca1-mutierten Krebszellen vermitteln Zellmigration in vitro

Wir haben zuvor CD24+CD29+-Zellen und CD24+CD49f+-Zellen, die mit krebsinitiierenden Zellen oder CSCs angereichert sind, aus primären Brusttumoren isoliert, die in Brca1-mutierten Mäusen oder aus einer kultivierten Zelllinie entwickelt wurden, (W0069), die aus einem Brca1-Mammatumor gewonnen wurde.39 Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu testen, sortierten wir CD24+CD29+-Zellen (CSCs) und CD24-CD29–Zellen (Nicht-CSCs) aus der W0069-Zelllinie, die, wie bereits gezeigt, etwa 15 % CD24+CD29+-Zellen enthält,39 und untersuchten die Migrationsfähigkeit mit Hilfe des Wundheilungs- und Transwell-Assays. Nach 24 Stunden zeigten CD24/CD29-doppel-positive Zellen eine bessere Migrationsfähigkeit als die doppelt-negativen Zellen, wie die Wundgröße zeigte (Abbildung 1a). Der Transwell-Migrationstest zeigte auch einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der migrierten Zellen sowohl an der Unterseite des Filters (175,6±19 vs. 54,2±18,1, **P<0,01) als auch in der unteren Kammer des Transwells (82,3±5,5 vs. 4,3±2,1 Kolonien, **P<0,01) (Abbildung 1b). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, als wir verschiedene Subklone untersuchten, die von derselben Zelllinie stammten und entweder positiv oder negativ auf das Vorhandensein von CSCs getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Um zu bestätigen, dass CSCs eine erhöhte Motilität aufweisen, mischten wir verschiedene Mengen von W0069-Zellen mit doppelt negativen Zellen, die aus der W0069-Zelllinie sortiert wurden. Wie in Abbildung 1c gezeigt, nahm die Migrationsfähigkeit ab, wenn die Anzahl der doppelt-positiven Zellen verringert wurde, obwohl die Gesamtzahl der verwendeten Zellen durch Erhöhung der Anzahl der CD24-CD29-Zellen stabil blieb. Ausgehend von 5 × 104 W0069-Zellen stellten wir fest, dass die migrierten Zellen 52,6±15,5 Kolonien in der unteren Kammer bildeten. Wurden 4 × 104 W0069-Zellen mit 1 × 104 doppelt-negativen Zellen gemischt, verringerte sich die Zahl der Kolonien auf 16±2,6. Die Zahl der Kolonien nahm weiter ab, als wir die Zahl der W0069-Zellen weiter verringerten und die Zahl der CD24-CD29-Zellen erhöhten (Abbildung 1c). Dieselben Ergebnisse wurden erzielt, wenn W0069-Zellen mit einem Subklon (W0069-202) gemischt wurden, der nur CD24-CD29-Zellen enthält (ergänzende Abbildungen 1a und b). Umgekehrt konnten wir zeigen, dass die Anzahl der Kolonien zunahm, wenn die Anzahl der verwendeten CD24+CD29+-Zellen schrittweise erhöht wurde (ergänzende Abbildung S1c). Um die Rolle der CSCs bei der Migration weiter zu verifizieren, wurden mit W0069-grünem Fluoreszenzprotein markierte Zellen, die positiv für das Vorhandensein von CSCs sind, verwendet und mit sortierten, nicht markierten CD24-CD29-Zellen gemischt. Durch die Erhöhung der Anzahl positiver Zellen konnten wir einen Anstieg der Anzahl der von den migrierten Zellen gebildeten Kolonien feststellen, und alle gebildeten Kolonien waren grün, wenn sie unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft wurden, was bedeutet, dass die Migration nur dann zu sehen ist, wenn CD24+CD29+-Zellen in der Zellkultur vorhanden sind (Abbildung 1d und e). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass CSCs in Brca1-mutierten Krebszelllinien eine erhöhte Beweglichkeit aufweisen.

CSCs in Brca1-mutiertem Krebs vermitteln Krebsmetastasen in vivo

Als nächstes untersuchten wir die potenzielle Rolle von CSCs bei der Metastasierung in vivo. Frisch sortierte CD24+CD29+ und CD24-CD29- Zellen sowie Subklone, die für dieselben Marker positiv oder negativ sind, aus der W0069-Zelllinie wurden in die Brustdrüse von 6-8 Wochen alten jungfräulichen athymischen (Nackt-)Mäusen implantiert. Zunächst stellten wir fest, dass das Tumorwachstum langsamer war, wenn sortierte CD24-CD29-Zellen mit CD24+CD29+-Zellen verglichen wurden (Abbildung 2a und b), was mit der Vorstellung übereinstimmt, dass diese Population für CSCs angereichert ist.39 Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn Subklone verwendet wurden, die entweder positiv oder negativ für das Vorhandensein von CSCs waren (Daten nicht gezeigt). Obwohl Mäuse, denen CD24+CD29+-Zellen injiziert wurden, aufgrund größerer Tumorlasten früher getötet werden mussten (Tag 49-54) als Mäuse, denen CD24-CD29–Zellen injiziert wurden (Tag 60-69), kam es in der Gruppe der Mäuse, denen CD24+CD29+-Zellen injiziert wurden, zu einem signifikanten Anstieg von Metastasen. Insbesondere hatten 3/15 Mäuse, denen negative Zelllinien implantiert wurden, einen kleinen Tumorknoten in der Lunge pro Maus (Abbildung 2c und d). Im Gegensatz dazu wiesen 13/18 Mäuse, denen positive Zelllinien implantiert worden waren, metastatische Knötchen in der Lunge auf, insgesamt über 100 Knötchen (diese Zahl könnte unterschätzt werden, da die meisten Knötchen viel größer waren und die Knötchen nicht genau gezählt werden konnten, wenn sich zu viele in einer Lunge befanden) (Abbildung 2c und d). Da der Unterschied in der Größe des Primärtumors zwischen den positiven und den negativen Tumoren etwa siebenmal so groß war (5000mm3/700mm3), hatten wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass der Unterschied in der Metastasierung auf den Unterschied im Tumorwachstum zurückzuführen sein könnte. Es ist jedoch bekannt, dass die Metastasierung von Tumoren eher im Anfangsstadium beginnt, wenn die Tumoren klein sind, als in späten Stadien, wenn sie groß sind,40 was gegen diese Möglichkeit spricht. Darüber hinaus beträgt der Unterschied in der Anzahl der Knötchen etwa das 33-fache (100/3), und die meisten Knötchen, die von doppelt-positiven Zellen stammen, sind viel größer als die von doppelt-negativen Zellen, was die unterschiedliche Metastasierungsfähigkeit der beiden Subpopulationen unterstreicht. Hinsichtlich der Herkunft der drei metastatischen Knoten ist es möglich, dass die doppelt-negative Population noch einige Zellen enthält, die eine geringere Fähigkeit zur Krebsentstehung und Metastasierung haben. Alternativ dazu könnten einige CD24-CD29-Zellen diese Fähigkeiten durch Entdifferenzierung erlangen. Dies sind interessante Fragen, die weitere Untersuchungen verdienen.

CD29 und CD49f spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Krebsmetastasen

Interessanterweise ergab die Profilierung dieser metastatischen Tumoren durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse unter Verwendung von CD24- und CD29-Markern, dass die aus den doppelt positiven Zelllinien stammenden Tumoren ein ähnliches Profil aufwiesen wie die Primärtumore oder die ursprüngliche Krebszelllinie (Abbildung 3a, links). Da nur CSCs innerhalb des Tumors die ursprüngliche Tumorheterogenität rekapitulieren können, deutet dies darauf hin, dass CSCs metastasieren und die Bildung der metastatischen Tumoren vorantreiben. Im Gegensatz dazu wurden in den Tumoren der negativen Zelllinien auch nach der Metastasierung keine doppelt positiven CD24- und CD29-Zellen nachgewiesen (Abbildung 3a, rechts), wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse ergab. Darüber hinaus konnten wir durch Immunfluoreszenzfärbung CD24+CD29+-Zellen in metastatischen Knoten in der Lunge von Tumoren nachweisen, die durch die Implantation von CD24+CD29+-Zellen initiiert wurden (Abbildung 3b), nicht aber von Tumoren, die durch die Implantation von CD24-CD29–Zellen initiiert wurden (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass CD24+CD29+-Zellen eine höhere Mobilität als CD24-CD29–Zellen aufweisen, wurden bei der Färbung mit Antikörpern gegen CD24 und CD29 auch CD24+CD29+-Zellen in wandernden Zellen während des Wundheilungstests nachgewiesen (Abbildung 3c). Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass CSCs sowohl in vitro als auch in vivo eine erhöhte Motilität aufweisen und eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung von Brca1-mutierten Mammatumoren spielen.

Bei CD29 (β1-Integrin) und CD49f (α6-Integrin) handelt es sich um Integrin-Untereinheiten, die als extrazelluläre Matrixrezeptoren dienen.41 Da die extrazelluläre Matrix an der Zellmobilität und der Krebsmetastasierung beteiligt ist,41 wollten wir herausfinden, ob CD29 und CD49f nur als Marker für CSCs dienen oder ob sie tatsächlich eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Krebsmetastasierung haben. Zunächst schalteten wir CD29 in W0069- und CD24+CD29+-Zellen mit Hilfe einer individuellen kleinen interferierenden RNA (siRNA) aus, die auf den offenen Leserahmen von CD29 abzielt, und unsere Daten zeigten eine bemerkenswerte, jedoch nicht statistisch verringerte Zellmigration von siCD29-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 4a und b). Da CD29 und CD49f Heterodimere bilden, vermuteten wir, dass CD49f einige Funktionen kompensieren könnte, wenn die CD29-Expression beeinträchtigt ist. Um dies zu untersuchen, schalteten wir als Nächstes CD49f mittels siRNA in diesen Zellen aus (Abbildung 4a). Unsere Daten zeigten, dass die Ausschaltung von CD49f allein auch die Fähigkeit zur Zellmigration leicht auf ein ähnliches Niveau wie bei siCD29-behandelten Zellen reduzierte (Abbildung 4b). Eine deutliche Verringerung der Zellmigration, aber nicht der Zelllebensfähigkeit, wurde jedoch beobachtet, wenn beide gleichzeitig ausgeschaltet wurden (Abbildung 4a-d). Dieselben Ergebnisse wurden durch die Verwendung eines Pools von siRNAs gegen vier verschiedene Regionen im offenen Leseraster dieser Gene erzielt (ergänzende Abbildung 2a-c). Wir haben auch die Expression von vier verwandten Integrinen (Integrine α5 und 7 sowie Integrine β2 und 3) nach dem Ausschalten von CD29 und CD49f überprüft, und die Daten zeigen, dass diese siRNAs die Expression anderer Integrine nicht veränderten, was eine kreuzinhibitorische Aktivität dieser siRNAs auf andere Integrine ausschließt (ergänzende Abbildung 2d). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Integrine α6 und β1 eine sich überschneidende, jedoch kritische funktionelle Rolle bei der Migration von CSCs spielen könnten. Indem wir die Zellen anhand der Integrine α6 und β1 als Marker sortieren, reichern wir die Zellen an, bei denen diese Proteine eine funktionelle Rolle bei der Vermittlung der Zellmigration in vitro und der Krebsmetastasierung in vivo spielen können.

Die CSCs wiesen eine für den Übergang von Epithel zu Mesenchym charakteristische Genexpression auf

Um den Mechanismus zu verstehen, der der gesteigerten Metastasierungsfähigkeit der CSCs zugrunde liegt, haben wir morphologische und molekulare Analysen sowohl an CD24+CD29+ als auch an CD24-CD29- Zellen durchgeführt. Unsere Analyse ergab, dass die CD24-CD29-Zellen stärker membrangebundenes E-Cadherin, einen Marker für Epithelzellen, aufwiesen als CD24+CD29+-Zellen (Abbildung 4e). Bei der qRT-PCR-Analyse wurde auch eine höhere Expression von E-Cadherin in CD24-CD29-Zellen festgestellt als in CD24+CD29+-Zellen (Abbildung 4f). Im Einklang mit der geringeren Expression von E-Cadherin wiesen CD24+CD29+-Zellen auch eine höhere Expression verschiedener Markergene für mesenchymale Zellen auf, wie die qRT-PCR (Abbildung 4f) und die Western-Blot-Analyse zeigten (ergänzende Abbildung 2e). Da beide Zelltypen aus einem duktalen Mammakarzinom stammen, deutet die verstärkte mesenchymale Eigenschaft der CD24+CD29+-Zellen darauf hin, dass sie einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang durchlaufen haben, was eine molekulare Grundlage für ihre erhöhte Motilität in vitro und die Krebsmetastasierung in vivo bietet.

Zusammenfassend haben wir das metastatische Potenzial von CSCs untersucht, die in einer CD24+CD29+-Zellpopulation angereichert sind, die aus einem Brca1-mutierten Mausmodell für Brustkrebs isoliert wurde, und unsere Daten wiesen darauf hin, dass CSCs eine viel höhere Migrationsfähigkeit als Nicht-CSCs in Gewebekultur und ein erhöhtes metastatisches Potenzial in allogenen Nacktmäusen zeigten. Wir konnten zeigen, dass CD24+CD29+-Zellen die Fähigkeit zur Differenzierung und Wiederherstellung der Heterogenität in den metastatischen Tumoren beibehielten, während CD24-CD29–Zellen dies nicht konnten. Ein sehr interessantes Ergebnis ist jedoch, dass CD29 und CD49f, die als Marker für die Isolierung von CSCs aus Mäusemammatumoren verwendet wurden,39, 42, 43 eine sich überschneidende, aber entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Migration von CSCs spielen. Bei Mäusen ist β1-Integrin das am häufigsten exprimierte Integrin in Brustepithelzellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebsprogression.44 Bei menschlichem Brustkrebs hingegen wird α6-Integrin in hohem Maße exprimiert und dient als unabhängiger Prognosefaktor, wie eine Studie mit einem zeitabhängigen Effekt, der sich auf die ersten zwei Jahre der Nachbeobachtung beschränkt, gezeigt hat.45 Die potenzielle Rolle beider Gene bei zellulären Stammzelltransplantationen von Brustkrebs ist jedoch nach wie vor nicht klar. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Beeinträchtigung der Funktion von β1-Integrin oder α6-Integrin allein zu einer viel geringeren Wirkung führt als das gleichzeitige Ausschalten beider Gene. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Tatsache, dass beide Integrine sich miteinander paaren können, um Heterodimere für extrazelluläre Matrixkomponenten wie Fibronektin und Laminin zu bilden.41, 46, 47, 48, 49 Es wurde vorgeschlagen, dass ein malignes soziales Netzwerk die Zell-Zell-Adhäsion und die Kommunikation zwischen CSCs und ihrer Mikroumgebung vermittelt.20, 21 Unsere Studie deutet auf eine wichtige Rolle der β1/α6-Integrine bei der Vermittlung dieses Netzwerks hin. Insbesondere können β1/α6-Integrine die Interaktion zwischen CSCs und Stroma vermitteln, indem sie Signale der extrazellulären Matrix an die zelluläre Maschinerie weiterleiten und zu einer erhöhten Aktivität der CSCs in Bezug auf Lebensfähigkeit, Differenzierung und Metastasierung führen.