Dreidimensionale Rekonstruktion des Fütterungsapparats der Zecke Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): ein neuer Einblick in den Mechanismus der Blutfütterung

Röntgenbildgebung des weiblichen I. ricinus

Hier zeigen wir, dass der CRYTUR-Röntgenaufbau (basierend auf dem X-RayWorx-Mikrofokus, der Röntgenquelle und dem CRYCAM-Röntgendetektor) sehr gut geeignet ist, um eine schnelle und zerstörungsfreie Beobachtung der mit Osmium imprägnierten inneren Strukturen von weiblichen Zecken zu ermöglichen. Abbildung 1A zeigt die cheliceralen Retraktormuskeln, die bis in den Bereich der zweiten Beinpaare reichen, die Dicke der Kutikula, die Muskeln innerhalb der Beine und die Palpen (Abb. 1A, Movie 1). Das aus 2D-Röntgenprojektionsbildern gewonnene 3D-Modell lieferte weitere räumliche Informationen über die oberflächlichen Strukturen des weiblichen Körbchens (Abb. 1B), vergleichbar mit der Vorschaubildgebung durch das REM (Abb. 1D), wobei auch einige innere Strukturen (z. B. Muskeln, Basen der Cheliceren und des Pharynx) in verschiedenen virtuellen Schnitten sichtbar gemacht werden konnten (Abb. 1B). Die Auflösung der Röntgentomographie betrug 8,060 µm und wurde auf der Grundlage einer Fourier-Analyse aus einem rekonstruierten virtuellen Schnitt in der seitlichen Ebene in der Mitte des rekonstruierten Objekts berechnet. Wir haben ein Diagramm des radial gemittelten Leistungsspektrums erstellt und auf der Grundlage des Rayleigh-Kriteriums die Trennung von Signal und Rauschen bei 8,94 % des Abstands zwischen dem Rauschboden und dem Spitzenwert bewertet. Da das Röntgenmodell aus den Projektionsbildern im Bereich von 0° bis 180° mit einem Schritt von 10° rekonstruiert wurde, ist die Auflösung technisch nahezu isotrop. Diese Auflösung reichte jedoch nicht aus, um die Mundwerkzeuge der Nymphen zu beobachten (Abb. 1C,D, siehe den Vergleich der Größen der weiblichen und der nymphalen Mundwerkzeuge bei gleicher Vergrößerung).

Serialschnitt SEM

Das 3D-Modell des Fressapparates von I. ricinus Nymphe, das aus seriellen Ultradünnschnitten aus Harz rekonstruiert wurde, zeigte die Beziehungen des Speichelkanals und des Nahrungskanals zu den kapitulären Griffeln (Cheliceren, Hypostom) und anderen zugehörigen Strukturen, hauptsächlich Muskeln (Abb. 2, Filme 2 und 3)14.

Außerhalb des Capitulums werden Speichel und Blutmehl in einen schmalen Schlitz, den präoralen Kanal, ausgestoßen/gesaugt, der zwischen der Furche des Hypostoms auf der Ventralseite und den Cheliceren auf der Dorsalseite gebildet wird (Abb. 2A). Bei Rhipicephalus (früher Boophilus) microplus liegt eine dünne Membran, auch Rinne genannt, über der Hypostomafurche12. Interessanterweise fehlte diese Struktur bei Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 und I. ricinus. Innerhalb des Capitulums setzt sich Speichel/Blut in den Hohlraum des Salivariums fort, und dieser gemeinsame Weg endet durch eine Abtrennung eines Nahrungskanals vom Salivarium (Abb. 2A,B). Von der Dorsalseite der Zecke aus betrachtet, befindet sich der Nahrungskanal unterhalb des Speichelraums. Das Salivarium ist keine dauerhaft fixierte Struktur, sondern entsteht durch die Platzierung der Cheliceren oberhalb der Dorsalseite des Hypostoms. Der Nahrungskanal trennt sich vom gemeinsamen Weg, indem er in den Pharynx mündet. Sein Dach wird zunächst von einer winzigen Lamelle gebildet (Abb. 2B, grüner Pfeil), die sich in der Tiefe des Capitulums zu einem kurzen Stab vergrößert (Abb. 2C,I grün) und sich als größere sklerotisierte flügelartige Platte (auch Alae genannt) fortsetzt (Abb. 2E,I, grün). Alle diese Strukturen zusammen bilden ein Labrum. Am unteren Teil des Labrums befindet sich ein zahnähnlicher Fortsatz, der an die Pharynxöffnung angrenzt (Abb. 2C,E, schwarze Pfeile). Diese zahnähnliche Struktur wurde bei I. hexagonus, I. holocyclus und Rhipicephalus microplus beschrieben9,12,16. Der zahnähnliche Fortsatz scheint in eine Rille der Rachenöffnung zu passen, daher wird angenommen, dass er ein wichtiger Teil der Rachenschleimhaut ist. Die Identifizierung dieses zahnähnlichen Fortsatzes als Labrum ist durch seine Ähnlichkeit mit dem Labrum der Argasidenzecken gerechtfertigt, das sich ebenfalls vom Rachendach in den Nahrungskanal erstreckt13,16. Die anatomische Struktur des Nahrungskanals, des winzigen Labrums und des Ventils bei I. ricinus steht im Einklang mit dem langsamen Fütterungsprozess dieser Zecken, bei dem sich lange Saugimpulse mit dem Impuls der Speichelsekretion während der langen Blutfütterungsphase abwechseln. Bei Weichzecken hingegen erstreckt sich das Labrum distal über die gesamte Länge des Nahrungskanals. Dies steht im Einklang mit dem schnellen Fütterungsprozess bei diesen Zecken, bei dem das schnelle Flattern des Labrums mit schnellem Saugen und Speichelfluss synchronisiert wird, um innerhalb von nur 1-2 Stunden zu fressen13. Nach unseren EM-Beobachtungen war dieser vordere Teil des Pharynxdaches nicht mit Muskeln verbunden und bildet wahrscheinlich einen stationären (stützenden) Teil der Klappe (Abb. 2B). Das Pharynxdach ist mit subhypostomalen Platten verbunden, die die Seiten und einen Boden des Pharynx bilden (Abb. 2C, weiße Pfeile). Diese Platten sind mit den großen Dilatatormuskelbändern verbunden, die auf ihren gegenüberliegenden Seiten an der ventralen Cuticula befestigt sind. Die vorderen Dilatatormuskeln des Pharynx (ADM, in Abb. 2C, E, I als hellrosa gefärbte Strukturen dargestellt) befinden sich nur im vorderen Teil des Pharynx und ihre Kontraktion/Entspannung ermöglicht das Öffnen/Schließen des Ventils in der Pharynxöffnung9,12. Die ADM sind an der oberen Ecke und an den tiefliegenden Seiten des vorderen Teils des Pharynx befestigt. Der mittlere Teil der Rachenwände ist mit einer anderen Gruppe von Dilatatormuskeln verbunden, deren Kontraktion das Rachenlumen zur Seite hin erweitert. Diese lateralen Dilatatormuskeln des Pharynx (LDM) sind in Abb. 2G und als tiefrosa gefärbte Strukturen in Abb. 2I,J zu sehen. Die LDM ermöglichen eine massive Vergrößerung des Pharynxlumens, möglicherweise auch aufgrund der doppelten Y-förmigen Wand im vorderen Teil (Abb. 2G) und der dreifachen Y-förmigen Wand im hinteren Teil des Pharynx im Querschnitt (Abb. 2H), wie von Arthur et al.9 und Sonenshine und Anderson13 beschrieben. Der Wechsel von Kontraktion und Entspannung der beiden Dilatatormuskelgruppen erweitert den Rachen synchron mit der Öffnung der vorderen Klappe und erzeugt einen kräftigen Saugimpuls. Die Entspannung des LDM nach dem Schließen der Pharynxklappe drückt den Pharynx zusammen und treibt das verschluckte Blut nach hinten in die Speiseröhre und in den Mitteldarm. Die zeitliche Synchronisation zwischen dem Öffnen/Schließen der Rachenöffnung, das mit dem Öffnen und Schließen der Rachenklappe koordiniert wird, und der Kompression/Vergrößerung des Lumens im mittleren Teil des Rachens ermöglicht das Saugen sowie die Bewegung der Nahrung in die Speiseröhre und verhindert außerdem das Zurückwürgen des Blutes in den Wirt9,12. Die innere Auskleidung des Pharynx ist sklerotisiert, während die Ösophaguswand von Epithelzellen ausgekleidet ist (Abb. 2A). Der Ösophagus durchquert das Synganglion und geht in den Mitteldarm über (Daten nicht gezeigt).

Das Salivarium ist ein großer Hohlraum, der sich zwischen dem Pharynx und den Cheliceren befindet (Abb. 2A-E). Der vordere Teil des Salivariums wird sowohl für den Blut- als auch für den Speicheldurchgang genutzt, dann wird der Pharynx durch die winzige Lamelle (siehe oben) vom Boden des Salivariums getrennt. Das Dach und die Seitenwände des Speichelraums werden durch die sklerotisierte Cheliceralplatte (ChP in Abb. 2C,E,F und rote Struktur in Abb. 2M) verstärkt, die sich weiter in den Hohlraum des Zeckenkörpers hinein erstreckt. Im hinteren Teil des Salivariums sind die seitlichen Seiten dieser Platte mit Muskeln verbunden, die an gegenüberliegenden Enden an den Seiten der Körperhöhle der Zecke befestigt sind. Diese seitlichen Speichelmuskeln (LMS) sind in Abb. 2E,F,K,L hellviolett markiert. Durch die Kontraktion der Muskeln wird die Platte, die fest mit der Speichelwand verbunden ist, abgeflacht, was zu einer Verengung/Verschließung des inneren Raums des Speichelraums führt, allerdings nur in seinem hinteren Teil hinter der Abtrennung des Pharynx.

Außerdem ist der Boden des hinteren Endes des Speichelraums mit einer kleinen schrägen Muskelgruppe verbunden (Muskeln, die am Boden des Speichelraums ansetzen, MS in Abb. 2E,F,J,N, hellblau markiert), die an den gegenüberliegenden Teilen mit dem oberen Teil der Vorderseite des Pharynx verbunden ist. Diese Muskeln ermöglichen die Auf- und Abwärtsbewegung des hinteren Teils des Speichelbodens. Diese Muskeln wurden bereits bei weiblichen I. holocyclus beschrieben16. Die Möglichkeit, dass der Boden des Salivariums abgesenkt oder angehoben werden kann, wurde bereits früher im Zusammenhang mit schnellen Speichelausbrüchen vorgeschlagen, die auf der Aufzeichnung elektrischer Signale während des Speichelflusses von R. microplus und Dermacentor andersoni beruhten12,17,18,19,20. Während des Speichelflusses von R. microplus wurden schnelle (bis zu 30 pro Sekunde) Abwärtsausschläge der Leitfähigkeit, gefolgt von größeren Ausschlägen am Ende des Speichelflusses, beobachtet. Eine Erklärung für diese Messungen ist die Kontraktion der Muskeln im vorderen Teil des Rachens, die von einer ähnlichen Pulsation der Membran über dem Nahrungskanal (hypostomale Rinne) begleitet wird, die einen Kanal für den Speichelaustritt öffnet20. Wir vermuten, dass die kleinen schrägen Muskeln, die am Boden des Speichelraums ansetzen, Vibrationen erzeugen können, die die Speichelbewegung erleichtern. Aber auch die seitlichen Muskeln, die den Durchmesser des Speichelraumes beeinflussen, können dazu beitragen, den Speichel aus den Mundwerkzeugen auszustoßen (nicht in der Animation enthalten). Wir vermuten, dass die Bewegung der Cheliceren in der Haut des Wirtes ebenfalls dazu beitragen kann, den Speichel aus dem Speichelraum in die Haut des Wirtes zu befördern. Die Basis der Cheliceren (ChB in Abb. 2A,B) befindet sich direkt über dem Speichelkanal (von dorsal gesehen), und wir vermuten, dass diese Strukturen den Speichelkanal lokal zusammendrücken können, um den Speichelaustrieb zu unterstützen. Die leicht asynchronen Verlängerungen der Cheliceren wurden mit Hilfe der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie direkt an der Futterstelle während des gesamten Zeitraums der Nahrungsaufnahme von I. scapularis beobachtet21. Wir stellten fest, dass sich die Cheliceren nach der Anwendung von Pilocarpin auf die dorsale Kutikula von nicht gefütterten und teilweise gefütterten I. ricinus-Weibchen leicht asynchron zu bewegen beginnen (Filme 5 bzw. 6). Die Cheliceralbasen (ChB in Abb. 2A,B) befinden sich direkt über dem Speichelkanal (aus der Dorsalansicht), und wir können vermuten, dass diese Strukturen den Speichelkanal ausdehnen oder zusammendrücken und so zum Ausstoßen des Speichels beitragen können. Es ist bekannt, dass die Verabreichung von Pilocarpin, einem cholinergen, nicht endogenen Medikament, den Speichelfluss indirekt über das zentrale Nervensystem der Zecke auslöst22 , während seine Wirkung auf andere Gewebe der Zecke nicht bekannt ist. Daher können wir nicht ausschließen, dass die Pilocarpin-vermittelte Bewegung der Cheliceren in unseren Experimenten eine zusätzliche Wirkung dieses Medikaments in Zecken ist. Bockenstedt et al. schlugen vor, dass die Cheliceren Kollagenfasern zurückdrängen, die die Fraßstelle zusammendrücken können, was unsere Hypothese der durch Cheliceren vermittelten Speichelabgabe an den Wirt in hohem Maße bestätigt21.

Kurz vor dem Ende der Speichelhöhle münden paarige Speichelkanäle in die seitlichen Ecken12. Beide Speichelkanäle sind von einer Gewebeschicht umschlossen (TSD in Abb. 2C,E,F,M,N, dunkelviolett), die die Speichelkanäle wahrscheinlich flexibel an den seitlichen Ecken des Speichelraums befestigt.

Simulation des Speichelflusses und des Blutsaugens auf der Grundlage des 3D-Modells

Während des Fütterungsvorgangs bei ixodiden Zecken wechselt der Speichelfluss entweder mit langsamem oder schnellem Blutsaugen ab und kann eine Ruhephase beinhalten. Der prozentuale Anteil der Zeit, die für die einzelnen Aktivitäten während des Saugakts der Weibchen aufgewendet wird, ist unterschiedlich und hängt von der Tageszeit, der Größe der Zecken usw. ab18. In Film 4 haben wir sowohl den Nahrungskanal als auch den Kanal für den Speichelfluss mit den dazugehörigen Strukturen animiert und zeigen, wie diese Strukturen funktionieren. Der Fütterungsprozess der meisten Ixodid-Zecken beginnt mit der Absonderung zementartiger Substanzen, die es der Zecke ermöglichen, sich in der Haut des Wirts festzusetzen und den Spalt zwischen der Fütterungsläsion und den eingesetzten Mundwerkzeugen abzudichten23,24,25. Die Speichelphase kann durch einen kurzen Speichelausstoß beendet werden16,17,18,19. Das Ausstoßen von Speichel wird wahrscheinlich durch die Vibration des hinteren Teils des Speichelraumbodens erleichtert; auch die Bewegung der Cheliceralbasen kann eine Rolle spielen (Film 6). Bevor das Blutsaugen beginnt, wird die Öffnung des hinteren Teils des Speichelraums durch die seitlichen Muskeln verengt, die zwischen dem Speichelraumdach und der Seitenwand des Zeckenkörpers gespannt sind. Danach öffnet sich die Rachenklappe und der vordere Rachenraum wird durch die Kontraktion der vorderen Dilatatormuskeln erweitert. Anschließend wird der mittlere Teil des Rachens entlang seiner Längsachse gedehnt, und das Blut wird in den Rachen gesaugt. Die vordere Rachenklappe wird geschlossen, bevor sich die Rachenwand wieder zusammenzieht und das Blut nach hinten in die Speiseröhre gedrückt wird. Diese peristaltische Welle wiederholt sich, bis der Speichelfluss einsetzt. Zu Beginn des Speichelflusses entspannen sich die seitlichen Begrenzungsmuskeln des Speichelraums, wodurch sich der Hohlraum des Speichelraums vergrößert. Das wiederholte Absenken und Anheben des Speicheldaches in seinem hinteren Teil erleichtert wahrscheinlich die Abgabe von Speichel an den präoralen Kanal.