Biologische Uhren sind biochemische Oszillatoren, die etwa alle 24 Stunden zirkulieren und durch Licht und andere Umweltsignale zurückgesetzt werden können (entrained). Bei Tieren gibt es einen zentralen Oszillator im Gehirn, der das zirkadiane Verhalten des gesamten Organismus steuert, sowie periphere Oszillatoren in einigen Geweben. Die Oszillation entsteht durch eine transkriptionelle Rückkopplungsschleife, an der eine Reihe von Transkriptionsfaktoren für die Uhr beteiligt sind, darunter die Faktoren für Zeitlosigkeit (Tim), Periode (Per), Uhr (Clk) und Bmal1 sowie Cryptochrome. Kryptochrome werden in den Organen und Geweben aller Organismen ubiquitär exprimiert und sind im Allgemeinen Kernproteine, die die Genexpression regulieren. Die am besten untersuchten tierischen Cryptochrome sind das Drosophila-Cryptochrom Cry und die Maus-Cryptochrome Cry1 und Cry2, und auch die beiden Arabidopsis-Cryptochrome CRY1 und CRY2 wurden ausgiebig untersucht.
Drosophilacryptochrome
Drosophila Cry ist ein vorwiegend nukleäres Protein, das die Regulierung der zirkadianen Uhr durch Licht vermittelt, obwohl es auch im Zytosol vorkommt. Es reguliert die zirkadiane Uhr, indem es direkt mit dem Protein Tim interagiert, um die negative Rückkopplungsschleife der Uhr zu unterdrücken (Abbildung 3a). Licht stimuliert die Interaktion zwischen Cry und Tim, was die Ubiquitinierung und den proteosomenabhängigen Abbau von Tim fördert und die Bildung des Per-Tim-Heterodimers unterdrückt. Die Hemmung eines Heterodimers der Clock- und Cycle-Proteine durch das Per-Tim-Heterodimer wird somit aufgehoben und die Phase der zirkadianen Oszillation wird zurückgesetzt (Abbildung 3a). Cryptochrom ist jedoch offenbar nicht der einzige Photorezeptor, der die zirkadiane Uhr in Drosophila in Gang setzt. Die Verhaltensrhythmik der cryb-mutanten Fliege, der die Cry-Funktion fehlt, kann dennoch als Reaktion auf Licht gesteuert werden, es sei denn, die Signaltransduktion durch das Sehpigment wird ebenfalls ausgeschaltet. Zusätzlich zu seiner Rolle als Photorezeptor für die Steuerung des zentralen Oszillators von Drosophila spielt Cry auch eine lichtunabhängige Rolle bei der Funktion des peripheren zirkadianen Oszillators.
Regulierung der zirkadianen Uhr durch tierische Cryptochrome. (a) In Drosophila unterdrückt Cry die negative Rückkopplungsschleife der zirkadianen Uhr, indem es lichtabhängig an Tim bindet; dies führt zum proteosomenabhängigen Ubiquitin-vermittelten Abbau von Tim (Ubq, Ubiquitinierung) und damit zur Hemmung der Wirkung des Per-Tim-Heterodimers. Ohne Cry würde das Per-Tim-Heterodimer in den Zellkern eindringen und die Bindung der Taktgeberproteine (Per, Clk und Bmal1) an die E-Box in den Promotoren der Taktgebergene hemmen und so deren Expression verhindern. (b) Bei Säugetieren sind die Cryptochrome integraler Bestandteil der negativen Rückkopplungsschleife. Das Cry-Protein interagiert mit Per, um die Aktivität der Transkriptionsfaktoren Clk und Bmal1 zu unterdrücken und damit die Transkription zu hemmen. Cryptochrome sind möglicherweise auch an der Steuerung der zirkadianen Uhr von Säugetieren durch Licht beteiligt; es ist bekannt, dass Uhrengene als Reaktion auf neuronale Signale von der Retina als Reaktion auf Licht reguliert werden, aber es ist noch nicht klar, ob Cryptochrome daran beteiligt sind.
Säugetier-Kryptochrome
Die beiden Funktionen von Drosophila Cry – als Photorezeptor für die Steuerung der zirkadianen Uhr zusammen mit visuellen Pigmenten und als integraler Bestandteil des zirkadianen Oszillatorproteinkomplexes – sind auch Merkmale der Säugetier-Kryptochrome. Cryptochrome von Säugetieren sind überwiegend Kernproteine, kommen aber auch im Zytosol vor. Wie Drosophila Cry erfüllen Säugetier-Cryptochrome sowohl lichtabhängige als auch lichtunabhängige Funktionen bei der Steuerung der zirkadianen Uhr. Mehrere Beobachtungen belegen die lichtabhängige Rolle der Cry-Proteine bei Säugetieren. Knockout-Mäuse, denen ein oder beide Cry-Gene fehlen, sind weniger oder gar nicht in der Lage, die Expression von Genen wie per und des Protoonkogens c-fos als Reaktion auf Licht zu induzieren. Darüber hinaus zeigen die Pupillen von mutierten Mäusen, denen sowohl Cry1 als auch Cry2 fehlt, verminderte Reflexreaktionen auf Licht.
Andererseits zeigt die cry1-cry2-Doppelmutante eine scheinbar normale Rhythmizität unter Hell-Dunkel-Zyklusbedingungen, verliert aber die Rhythmizität augenblicklich und vollständig unter Freilaufbedingungen (immer dunkel). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Cry-Proteine eine wesentliche und lichtunabhängige Funktion im zentralen zirkadianen Oszillator der Säugetiere spielen und dass die Cryptochrome nicht die einzigen Photorezeptoren sind, die die Lichtsteuerung der Uhr vermitteln. Die Tatsache, dass Cryptochrome integrale Bestandteile des zentralen Oszillators der Maus sind, macht es fast unmöglich, ihre Rolle bei der Lichtsteuerung der Uhr direkt zu testen. Dennoch hat sich gezeigt, dass die cry-Mutante der Maus, ähnlich wie bei Drosophila, ihre Fähigkeit zur Vermittlung von Lichteinfall beibehält, wenn nicht gleichzeitig die Funktion der Sehpigmente gestört ist. Dreifach mutierte Mäuse, die Mutationen beider Cryptochrome zusammen mit einer retinal-degenerativen Mutation tragen, sind unter Hell-Dunkel-Zyklusbedingungen nahezu arrhythmisch. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cry-Proteine bei Säugetieren tatsächlich an der Regulierung der zirkadianen Uhr durch Licht beteiligt sind, ihre Rolle bei der Steuerung der zirkadianen Uhr durch Licht aber redundant von anderen Photorezeptoren wahrgenommen wird. Es scheint nun klar zu sein, dass die zusätzlichen Photorezeptoren, die zusammen mit den Cryptochromen für die Steuerung des zirkadianen Oszillators bei Säugetieren verantwortlich sind, die visuellen Stäbchen-Zapfen-Opsine und das verwandte Protein Melanopsin sind.
Wie Drosophila Cry interagieren die Cryptochrome bei Säugetieren physisch mit den Uhrenproteinen, einschließlich der Promotor-bindenden Transkriptionsregulatoren Per, Clk und Bmal1 (Abbildung 3b). Im Gegensatz zu Drosophila-Cry sind die Cry-Proteine von Säugetieren Bestandteile der negativen Rückkopplungsschleife der zirkadianen Uhr (Abbildung 3b). Die physische Interaktion von Cryptochrom mit anderen Uhrenkomponenten beeinflusst deren Aktivität, Interaktion, Abbau oder Kernwanderung und verändert folglich die Transkriptionsregulation der Uhrgene. Die Interaktion zwischen Cryptochromen und anderen Uhrenproteinen wie Per, Clk und Bmal1 scheint jedoch nicht durch Licht beeinträchtigt zu werden, was darauf hindeutet, dass solche Interaktionen möglicherweise nicht der Mechanismus zur Beeinflussung der zirkadianen Uhr durch Licht sind, wie es bei Drosophila der Fall ist. Neben der direkten Regulierung der Transkription durch physische Interaktion mit Promotor-bindenden Transkriptionsregulatoren können Cryptochrome auch die zirkadiane Uhr beeinflussen, indem sie an der Regulierung von Histonmodifikationen beteiligt sind, aber wie dies funktioniert, muss noch geklärt werden.
Arabidopsiscryptochrome
Arabidopsis CRY1 und CRY2 sind vorwiegend nukleare Proteine, die die Regulierung der Genexpression und die Steuerung der zirkadianen Uhr als Reaktion auf Licht vermitteln. CRY1 und CRY2 spielen eine wichtige Rolle in der pflanzlichen Photomorphogenese, z. B. bei der Hemmung der Stängelstreckung durch blaues Licht, der Stimulierung der Blattexpansion durch blaues Licht und der Regulierung der Blütenbildung durch die Tageslänge. Es scheint, dass Cryptochrome Entwicklungsveränderungen in Pflanzen über Veränderungen der Genexpression in Reaktion auf Licht steuern. CRY1 und CRY2 sind zusammen für blaulichtabhängige Veränderungen der Genexpression von bis zu 10-20 % des Arabidopsis-Genoms verantwortlich.
Es gibt mindestens zwei Mechanismen, durch die Cryptochrome Veränderungen der Genexpression im Kern als Reaktion auf Licht beeinflussen können. Erstens kann ein Cryptochrom-Molekül mit Proteinen interagieren, die mit der Transkriptionsmaschinerie verbunden sind, um die Transkription direkt zu beeinflussen. In Arabidopsis bindet CRY2 unabhängig von der DNA-Sequenz an Chromatin (und M. Maymon und C.L., unveröffentlichte Beobachtungen), aber es ist unklar, wie ein sequenzunabhängiges Protein, das mit Chromatin interagiert, die Genexpression regulieren kann. Im Gegensatz zu den tierischen Cryptochromen, die nachweislich die Transkription über physikalische Interaktionen mit Promotor-bindenden Transkriptionsregulatoren regulieren, wurde für pflanzliche Cryptochrome keine derartige Interaktion berichtet. Ein alternatives Modell sieht vor, dass Pflanzencryptochrome mit Proteinen interagieren, die andere zelluläre Funktionen ausüben, um die Stabilität, Modifikation und den zellulären Transport der Transkriptionsregulatoren zu regulieren. So wurde beispielsweise festgestellt, dass pflanzliche Cryptochrome mit einer E3-Ubiquitin-Ligase, COP1, interagieren, was darauf hindeutet, dass pflanzliche Cryptochrome auf eine Weise wirken, die für tierische Cryptochrome noch nicht entdeckt wurde. Im Einklang mit dieser Ansicht wurde vor kurzem auch festgestellt, dass Arabidopsis-Cryptochrome die Unterdrückung des proteasomabhängigen Abbaus eines wichtigen Blütenregulators, CONSTANS, durch blaues Licht vermitteln. Wie die Cryptochrome dies genau bewerkstelligen, muss noch weiter untersucht werden.
Mechanismus
Der katalytische Mechanismus der Cryptochrome ist noch nicht vollständig geklärt, doch lassen sich einige Hinweise auf den Mechanismus der CPD-Photolyasen finden, bei denen FAD die wichtigste katalytische Rolle spielt. Bei einer DNA-Reparaturreaktion bindet die CPD-Photolyase an das Pyrimidin-Dimer der DNA und „kippt“ es aus dem DNA-Duplex in die FAD-Zugangskavität des Enzyms, um einen stabilen Komplex zu bilden. Das andere Chromophor (Pterin oder Deazaflavin), das auch als „Antennen“-Chromophor bezeichnet wird, absorbiert Photonen des blauen oder UV-A-Lichts und überträgt die Anregungsenergie auf das Flavin des FAD. Im angeregten Zustand gibt Flavin ein Elektron an das Pyrimidin-Dimer ab, um den Cyclobutanring zu spalten. Bei diesem Prozess wird das Elektron zurück auf Flavin übertragen, was zur Regeneration von Flavin im Grundzustand führt. Das reparierte Dinukleotid passt nicht mehr in den FAD-Zugangshohlraum, so dass es sich von der Photolyase abspaltet. Die genaue Rolle von FAD und der FAD-Zugangskavität in der Funktion von Cryptochromen bleibt unklar, aber es ist denkbar, dass sie auch an Elektronentransferreaktionen beteiligt sind.
Obwohl die PHR-Region, die das/die Chromophor(e) enthält, der am meisten konservierte Teil der Proteine ist, hat sich gezeigt, dass die Carboxy-terminale Domäne eine Rolle in der Funktion oder Regulierung sowohl von tierischen als auch pflanzlichen Cryptochromen spielt. Die Expression der Carboxy-terminalen Domänen von Arabidopsis-Cryptochromen, die mit dem Marker-Enzym b-Glucuronidase fusioniert sind, führt zu einer konstitutiven Wachstumsreaktion auf Licht, auch in der Dunkelheit, wenn die PHR-Region fehlt. Im Gegensatz dazu sind die PHR-Regionen der Cryptochrome von Drosophila und Xenopus in Abwesenheit der carboxyterminalen Domäne physiologisch aktiv. Die carboxyterminale Domäne von Drosophila Cry ist wichtig für die Proteinstabilität, die Interaktion mit Tim und die Empfindlichkeit des Photorezeptors gegenüber zirkadianen Lichtsignalen, während die carboxyterminale Domäne von Xenopus Cry für seine nukleare Lokalisierung erforderlich ist.
Cryptochrome werden durch Phosphorylierung reguliert. Es wurde gezeigt, dass Arabidopsis-Cryptochrome als Reaktion auf blaues Licht phosphoryliert werden und dass dies mit der Funktion und Regulierung der Photorezeptoren zusammenhängt. Darüber hinaus wurde bei der Expression von Arabidopsis CRY1 in Insektenzellen eine ATP-abhängige und von Blaulicht abhängige Autophosphorylierung festgestellt. Es ist nicht bekannt, ob tierische Cryptochrome ebenfalls an ATP binden, obwohl gezeigt wurde, dass Maus-Cryptochrome phosphoryliert werden.
Die Wechselwirkung zwischen der CRY1-PHR-Region von Arabidopsis und ATP weist einige interessante Merkmale auf, die an die Wechselwirkung zwischen Pyrimidin-Dimer und Photolyase erinnern: Die Phosphatgruppen von ATP sind dem Lösungsmittel ausgesetzt; die Adenin- und Ribose-Einheiten sind tief in der FAD-Zugangshöhle vergraben; und ATP kann einen durch Wasser vermittelten Kontakt mit FAD haben. Der Interaktion der Arabidopsis CRY1 pHR-Region mit ATP fehlen auch mehrere Merkmale, die üblicherweise in Protein-ATP-Interaktionen zu finden sind, wie Protein-Phosphat-Interaktion, Protein-Mg2+-Kontakt und ein nahe gelegener Serinrest für den Phosphotransfer. Eine Untersuchung der Topologie der Struktur der CRY1-PHR-Region zeigt jedoch, dass alle diese Merkmale möglicherweise von der carboxyterminalen Domäne des Cryptochroms bereitgestellt werden könnten (Abbildung 4). Die Beobachtung, dass die serinreichen Carboxy-terminalen Domänen von Arabidopsis-Cryptochromen, die mit β-Glucuronidase fusioniert sind, in vivo konstitutiv phosphoryliert sind (, deutet darauf hin, dass ein Phosphotransfer von ATP, das an die FAD-Zugangskavität gebunden ist, auf die nahe gelegene Carboxy-terminale Domäne stattfinden kann (Abbildung 4a). Es ist auch denkbar, dass durch Photonen angeregtes FAD einen Elektronentransfer zum Nukleotid und einen Phosphotransfer von ATP zu Serinresten der carboxyterminalen Domäne auslöst. Da die Oberfläche der PHR-Region überwiegend negativ geladen ist, insbesondere an der Stelle, an der die carboxyterminale Domäne wahrscheinlich mit ihr interagiert, würde die phosphorylierte carboxyterminale Domäne dann von der Oberfläche der PHR-Region abgestoßen werden, was zu einer Änderung der Cryptochrom-Konformation führen würde. Diese Konformationsänderung würde es ihm ermöglichen, mit anderen Signalproteinen zu interagieren und das Lichtsignal zu verbreiten (Abbildung 4a). Alternativ könnte auch ein anderes Cryptochrom-Molekül, das an die FAD-Zugangskavität bindet, die fehlenden Merkmale für eine produktive ATP-Cryptochrom-Interaktion liefern. In der Tat können sowohl CRY2-CRY2-Wechselwirkungen als auch CRY1-CRY2-Wechselwirkungen in Arabidopsis nachgewiesen werden (D. Shalitin, X. Yu und C.L., unveröffentlichte Beobachtungen). Die Bildung eines Homo-Oligomers oder eines Hetero-Oligomers von Cryptochromen würde einen Mechanismus für den intermolekularen Phosphotransfer bieten, der die Struktur der Cryptochrome verändern kann (Abbildung 4b, c).
Mögliche Modelle für die phosphorylierungsabhängigen Strukturveränderungen von Pflanzencryptochromen als Reaktion auf blaues Licht. Die PHR-Region ist überwiegend negativ geladen (-), und die Carboxy-terminale Domäne (C) kann durch Phosphorylierung (die ATP erfordert und anorganisches Phosphat, Pi, freisetzt) negativ geladen werden. In allen Modellen führt die Phosphorylierung zur Bindung von unbekannten Signalpartnern (X, Y, Z) und zur Regulierung der Pflanzenentwicklung. (a) Ein Modell besagt, dass die Phosphorylierung der Carboxy-terminalen Domäne als Reaktion auf Licht durch ATP erfolgt, das an die PHR-Region gebunden ist; dies führt zur Dissoziation der beiden Domänen. (b) Eine zweite Möglichkeit ist, dass der Phosphotransfer als Reaktion auf Licht die Interaktion von zwei Cryptochromen beinhaltet, die von demselben Gen kodiert werden. (c) Alternativ dazu könnte der intermolekulare Phosphotransfer die Interaktion verschiedener Cryptochrome beinhalten. Alle drei Szenarien können in Pflanzenzellen vorkommen, und die Aktivität eines Kryptochroms kann durch die Kinetik der verschiedenen Reaktionen bestimmt werden.