Abstract
Disaccharidasen (DS) sind Bürstensaumenzyme, die in der mikrovillösen Membran der Dünndarm-Enterozyten eingebettet sind. Bei unbehandelter Zöliakie (CD) wird eine allgemeine Abnahme der DS-Aktivitäten beobachtet. In diesem Manuskript werden verschiedene Aspekte der DS-Aktivitäten bei Zöliakie untersucht: ihr Nutzen für die Diagnose und ihre Anwendung bei In-vitro-Toxizitätstests. Letzteres hat sich in der CD-Forschung nie durchgesetzt. Mit den jüngsten Fortschritten in der Technik der Dünndarmorganoide könnte DS jedoch als Biomarker für In-vitro-Studien eingesetzt werden. Dazu gehört die Etablierung sich selbst erneuernder Epithelzellen, die aus Gewebe gewonnen werden und Differenzierungsmarker, einschließlich der Bürstensaumenzyme, exprimieren. Die Bestimmung der DS-Aktivitäten im Zwölffingerdarm kann zusätzliche Informationen bei der Diagnose von CD liefern: (i) Quantifizierung des Schweregrads der beobachteten histologischen Läsionen, (ii) Bereitstellung von Vorhersagewerten für den Grad der Zottenatrophie der Schleimhaut und (iii) Unterstützung bei der Diagnose von CD, wenn geringfügige histologische Veränderungen festgestellt werden. DS können auch zusätzliche Informationen zur Beurteilung des Ansprechens auf eine glutenfreie Diät liefern, da vier Wochen nach Beginn der Diät ein deutlicher Anstieg ihrer Aktivitäten zu verzeichnen ist. Verschiedene endogene und exogene Faktoren, die sich auf DS auswirken, könnten auch bei der Untersuchung der Rolle von DS bei anderen Erkrankungen, einschließlich Nicht-Zöliakie-Glutensensitivität und DS-Mangel, von Bedeutung sein.
1. Einleitung
Bei einigen Personen stehen gastrointestinale Symptome, einschließlich Durchfall, im Zusammenhang mit der Aufnahme bestimmter Formen von Kohlenhydraten aus der Nahrung. Die Symptome sind auf einen oder mehrere Enzymmängel in der Dünndarmschleimhaut zurückzuführen, die Disaccharide hydrolysieren. Dazu gehören Laktasemangel (angeborener und erwachsener Typ), Sucrase-Isomaltase-Mangel, Maltase-Glucoamylase-Mangel und Trehalase-Mangel. Mit Ausnahme des Laktasemangels bei Erwachsenen sind die anderen oben genannten Mangelerscheinungen relativ selten. Andere Erkrankungen, einschließlich Zöliakie (CD), die zu einer Schädigung des Dünndarms führen, können eine Verringerung der Disaccharidase-Aktivitäten (DS) verursachen. Es wurde auch vermutet, dass ein sekundärer DS-Mangel möglicherweise für die Symptome bei CD-Patienten mit intakten Zotten verantwortlich ist.
Laktose, die durch das Bürstensaumenzym Laktase verdaut wird, gehört zu den schlecht absorbierten kurzkettigen Kohlenhydraten, die oft als FODMAPs (fermentierbare Oligo-, Di-, Monosaccharide und Polyole) bezeichnet werden. Es hat sich gezeigt, dass eine reduzierte FODMAP-Aufnahme die gastrointestinalen Symptome bei Patienten mit nicht-zöliakischer Glutensensitivität (NCGS) verbessert. Es wurde nachgewiesen, dass andere Komponenten als Gluten in Weizen bei NCGS von Bedeutung sein könnten, nämlich Amylase-Trypsin-Inhibitor . Das Fehlen von Biomarkern für diese Erkrankung könnte Forscher dazu veranlassen, die mögliche Rolle von Bürstengrenzenzymen wie Laktase zu untersuchen.
Bei unbehandelter CD ist eine allgemeine Abnahme der DS-Aktivitäten zu beobachten. Vor dem Aufkommen der serologischen Tests waren die DS-Aktivitäten im Dünndarm wichtige Laborparameter zur Unterstützung der Diagnose von CD. Die Bestimmung der individuellen DS-Aktivität war auch für die Differentialdiagnose von angeborenen Stoffwechselstörungen von entscheidender Bedeutung. Die Messung ihrer Aktivität hilft bei der Unterscheidung zwischen primären und sekundären DS-Mängeln. Bei primären DS-Mängeln handelt es sich um „angeborene Stoffwechselstörungen“ eines bestimmten Enzyms. Ein Beispiel hierfür ist der angeborene Laktasemangel, bei dem normale Maltase- und Sucrasewerte bei reduzierter Laktase vorhanden sind. CD ist ein sekundärer DS-Mangel, da alle DS aufgrund einer glutenbedingten Schädigung der Dünndarmschleimhaut reduziert sind.
Vier Wochen nach Beginn einer glutenfreien Diät (GFD) kommt es zu einem deutlichen Anstieg der DS-Aktivitäten, die jedoch wieder abnehmen, wenn Zöliakiepatienten zu einer normalen Ernährung zurückkehren. Bei Patienten mit behandelter CD führt die intraduodenale Instillation von Gluten innerhalb von 3,5 Stunden zu charakteristischen histologischen Veränderungen und einer damit verbundenen deutlichen Abnahme der Disaccharidase-Aktivitäten. Die Verringerung der DS-Aktivitäten korreliert mit dem histologischen Grad der Biopsie, so dass die DS als Biomarker für CD verwendet werden könnte.
In diesem Manuskript werden verschiedene Aspekte der DS-Aktivitäten bei CD untersucht: ihr Nutzen für die Diagnose und ihre Anwendung bei In-vitro-Toxizitätstests. Darüber hinaus werden die jüngsten Fortschritte in der Technik der Dünndarm-Organoide, einschließlich der Kokultur mit Immunzellen, beschrieben, die eine interessante Möglichkeit zur Entwicklung moderner In-vitro-Modelle für die CD-Forschung bieten. In diesem Modell könnten Bürstengrenzenzyme als Marker für die CD-Pathogenese eingesetzt werden.
2. Diagnostische Aspekte der Dünndarm-Disaccharidase-Aktivitäten bei CD
Der Goldstandard für die Diagnose von CD und die Verfolgung der Wirkung von GFD ist die Untersuchung von Duodenalbiopsien in Verbindung mit CD-Serologie einschließlich Gewebetransglutaminase. Die Messung der DS-Aktivitäten liefert zusätzliche Informationen zum Zeitpunkt der Diagnose und während der Nachuntersuchung, um das Ansprechen auf eine GFD zu beurteilen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Bestimmung der DS-Aktivitäten die Diagnose von CD erleichtern kann, wenn leichtere histologische Veränderungen, einschließlich Marsh-I- und -II-Anomalien in Dünndarmbiopsien, auftreten.
2.1. Positiver und negativer Vorhersagewert der Mucosal Villous Atrophy
Die Messung der Bürstensaum-Enzymaktivitäten bietet ein zusätzliches objektives Instrument zur Bewertung des Schweregrades der histologischen Anomalien bei unbehandelten Zöliakiepatienten. Duodenale DS-Aktivitäten sind gute Prädiktoren für den Grad der Zottenatrophie bei CD. Die positiven prädiktiven Werte für eine mäßige oder schwere Zottenatrophie sind wie folgt:(i)90% für Maltase (Maltase U/g Protein)(ii)86% für Sucrase (<40 U/g Protein)(iii)71% für Lactase (<20 U/g Protein).
Erniedrigte Maltase- und Sucrase-Aktivitäten haben somit einen hohen positiven prädiktiven Wert für den Grad der Zottenatrophie der Schleimhaut. Der Vorhersagewert der Laktaseaktivität ist geringer, was wahrscheinlich auf das Vorliegen eines primären Laktasemangels bei Zöliakiepatienten zurückzuführen ist. Kein Patient mit DS-Aktivitäten im Normalbereich wies eine schwere Zottenatrophie auf.
2.2. Schleimhautheilung bei CD mit einer glutenfreien Diät
Es ist bekannt, dass die Enzymaktivitäten an der Bürstengrenze bei unbehandelten Zöliakiepatienten reduziert sind. Allerdings erholen sich die Aktivitäten während der Remission, insbesondere vier Wochen nach Beginn einer GFD. Es ist wichtig, die unterschiedlichen Reaktionen zwischen der DS und einer GFD zu beachten; die Aktivitäten der Alpha-Glucosidasen steigen deutlich an, während die Lactase-Aktivität bei vielen Patienten niedrig bleibt. Peña et al. haben gezeigt, dass die Laktaseaktivität auf eine GFD unterschiedlich reagiert: Manchmal erholt sie sich innerhalb weniger Monate vollständig, manchmal bleibt sie aber auch jahrelang niedrig. Das Alter des Patienten ist von großer Bedeutung für die Geschwindigkeit der Erholung der Laktaseaktivität. Patienten unter 30 Jahren erholen sich in der Regel innerhalb weniger Monate vollständig, während die meisten älteren Patienten in dieser Zeit nur eine geringe oder gar keine Erholung zeigen. Das Fortbestehen niedriger Laktaseaktivitäten trotz guter histologischer Besserung wurde in anderen Studien bei einigen Patienten, insbesondere bei Erwachsenen, nachgewiesen.
Mit Ausnahme der Laktase kann die Messung der DS einen quantitativen Index für die Besserung der Dünndarmschleimhaut liefern; ihr Anstieg korreliert gut mit der Erholung der Schleimhaut auf der Grundlage der Histologie der Dünndarmbiopsie. Neben der histologischen und serologischen Verlaufskontrolle bietet die Messung der DS-Aktivitäten ein zusätzliches potenzielles Instrument zur Bewertung der Behandlung von CD mit einer GFD. Die Sucrase-Aktivität ist der beste Indikator für die Reaktion der Schleimhäute auf eine GFD. Interessanterweise steigt die Sucrase-Aktivität im distalen Zwölffingerdarm auch nach einer zweijährigen Behandlung der CD mit einer GFD nicht auf das Niveau der Kontrollgruppe an, obwohl klinische Auswirkungen früher zu beobachten sind. Im Allgemeinen sind die Enzymaktivitäten in den Dünndarmschleimhäuten von Patienten mit CD in Remission niedriger als die von Kontrollgruppen, die hinsichtlich Alter, Geschlecht und Ort der Biopsie gleich sind. Zöliakiepatienten, die eine GFD einhalten, weisen jedoch signifikant erhöhte Maltase- und Sucrase-Werte auf, während die Laktase-Aktivität im Vergleich zu einer unbehandelten Gruppe nur geringfügig ansteigt. Es ist erwähnenswert, dass eine strenge GFD nicht nur bei CD, sondern auch bei CD-assoziierten sekundären DS-Mängeln die Behandlung der Wahl ist.
2.3. Diagnose von CD mit Marsh I/II Score von Dünndarmschleimhautbiopsien (subklinische CD)
Bei Dünndarmschleimhautbiopsien mit einem Marsh Score von I und/oder II liegt keine Zottenatrophie vor. Die Zottenatrophie stellt nur das Endstadium im klinischen Verlauf der Krankheit dar; die CD entwickelt sich allmählich von einer Dünndarmschleimhautentzündung zu einer Kryptenhyperplasie und schließlich zu einer Zottenatrophie.
Mildere Biopsieveränderungen, die sich auf eine lymphozytäre Infiltration mit oder ohne Kryptenhyperplasie beschränken, können zusätzliche Daten erfordern, um die Sicherheit einer CD-Diagnose zu erhöhen, da diese histologischen Veränderungen nicht ausschließlich für die CD typisch sind. Die Diagnose von CD kann durch eine Genotypisierung (HLA-DQ2 oder HLA-DQ8) verbessert werden; serologische Marker und immunhistochemische Färbungen der γδ+ve intraepithelialen Lymphozyten, die bei Patienten mit CD gefunden werden, können ebenfalls zur Bestätigung der Diagnose herangezogen werden.
Die Schädigung der Mikrovilli kann eine der frühesten gluteninduzierten Veränderungen bei CD sein. Daher können biochemische Veränderungen den lichtmikroskopisch festgestellten histologischen Anomalien in der Duodenalbiopsie vorausgehen. Murray et al. berichteten, dass bei 4 von 37 (10,8 %) Patienten, die bei ihrer ersten Biopsie einige Jahre zuvor keine Zottenatrophie aufwiesen, bei einer erneuten Biopsie CD diagnostiziert wurde. Diese vier Patienten hatten jedoch bei ihrer ersten Biopsie eine verminderte DS-Aktivität und geringfügige histologische Veränderungen (Marsh I oder II). Reduzierte DS-Aktivitäten ohne Zottenatrophie können daher eine frühe CD darstellen.
Mones et al. beobachteten eine deutliche Reduzierung der DS-Aktivitäten bei pädiatrischen Patienten mit CD, deren histologische Veränderungen in ihren Dünndarmbiopsien als Marsh I oder II (mit intakten Zotten) eingestuft wurden. Ein positiver Test zur Vorhersage von CD wurde durch die folgenden Cut-off-Werte für die individuelle DS-Aktivität definiert: Laktase, ≤15 Einheiten/g Protein; Sucrase, ≤25 Einheiten/g Protein; Maltase, ≤100 Einheiten/g Protein; und Palatinase, ≤5 Einheiten/g Protein. Die diagnostische Sensitivität reichte von 74 % bis 85 %, wobei die höchste Sensitivität für Laktase beobachtet wurde. Die diagnostische Spezifität reichte von 57 % bis 91 %, wobei die höchste Spezifität für Sucrase festgestellt wurde. Der positive prädiktive Wert eines DS-Mangels zur Vorhersage von CD lag zwischen 70 % und 91 %. Der negative prädiktive Wert (ein normaler DS-Wert) lag zwischen 72 % und 76 % für die Vorhersage einer Biopsie, die nicht als CD eingestuft wurde. Ein in Zwölffingerdarm-Biopsien festgestellter DS-Mangel kann daher die Diagnose von CD in Biopsien mit intakten Zotten unterstützen. Ein ähnliches Ergebnis wurde in einer anderen Studie berichtet, in der die Auswertung der DS-Aktivitäten die Diagnose von CD bei einigen Patienten unterstützte.
3. Forschungsaspekte der Disaccharidase-Aktivitäten bei Zöliakie
DS-Aktivitäten in Dünndarmschleimhautbiopsien können mit der Dahlqvist-Methode bestimmt werden. Das Gewebe wird mit dem entsprechenden Disaccharid inkubiert und die freigesetzte Glukose durch einen kolorimetrischen Test mit TRIS-Glukoseoxidase-Reagenz bestimmt. Die Einheiten der DS-Aktivität werden als Mikromol hydrolysiertes Disaccharid pro Minute und Gramm Schleimhaut (Feuchtgewicht) angegeben.
3.1. Faktoren, die die Enzymaktivitäten beeinflussen
DS sind bei aktiver Zöliakie reduziert. Sie können auch bei anderen Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen, Nahrungsmittelallergien, Dyspepsie, Protein-Energie-Malabsorption, Immundefekten und Infektionskrankheiten (wie Giardiasis, Virusinfektionen und bakterielle Überwucherung des Dünndarms) vermindert sein. Die Abnahme der DS-Aktivitäten kann in der Regel durch eine erfolgreiche Behandlung der zugrunde liegenden Krankheit rückgängig gemacht werden. Interessanterweise kann DS auch bei Diabetikern abnormal erhöht sein. Eine Verringerung einzelner DS-Mängel ist bei primären DS-Mängeln zu beobachten, zu denen angeborene Laktoseintoleranz, Sucrase-Isomaltase-Mangel, Maltase-Glucoamylase-Mangel und Trehalase-Mangel gehören.
Bei gesunden Personen können die DS-Aktivitäten eine große Bandbreite an absoluten Werten aufweisen. Es gibt mehrere endogene und exogene Faktoren, die ihre Aktivitäten beeinflussen.
3.1.1. Endogene Faktoren
Die DS-Aktivitäten variieren entlang der Längsachse (Duodenum-Jejunum-Ileum) des Darms. Die Laktase-Aktivitäten erreichen ihr Maximum 50-200 cm vom Ligamentum Treitz entfernt und sind im distalen Ileum fast nicht vorhanden. Die Sucrase-Aktivitäten sind entlang des Dünndarms konstant. Maltase ist im distalen Ileum doppelt so häufig wie im proximalen Jejunum.
Die ethnische Zugehörigkeit wirkt sich auf die DS-Werte aus, wie ein Vergleich zwischen afrikanischen und finnischen Kindern mit normaler Zottenarchitektur zeigt; erstere wiesen niedrigere Aktivitäten von Laktase, Sucrase und Maltase im Duodenum auf. Etwa ein Drittel der finnischen Kinder weist eine Laktaseaktivität unterhalb des etablierten Referenzbereichs von 20 U/g Protein auf, im Gegensatz zu zwei Dritteln der afrikanischen Kinder.
Das Geschlecht hat keinen Einfluss auf die DS-Aktivitäten. Das Alter hat nur auf die Laktaseaktivität einen signifikanten Einfluss; sie nimmt mit dem Alter ab. Bei einigen schwarzen Kindern kann sich ein Laktasemangel nach dem Alter von 3 Jahren entwickeln und ist nicht mit einer Schleimhauterkrankung verbunden.
Der zirkadiane Rhythmus beeinflusst die DS-Aktivitäten. Außerdem korrelieren die Oszillationen der DS-Aktivitäten mit dem Rhythmus der Nahrungsaufnahme.
Fleckige Schleimhautveränderungen, die bei CD auftreten können, beeinflussen die absoluten Werte der DS-Aktivitäten, die in Biopsien gefunden werden. Jonsson et al. wiesen nach, dass der Variationskoeffizient der DS-Aktivität von Proben, die an zwei Stellen im Zwölffingerdarm entnommen wurden, bei etwa 30 % lag.
3.1.2. Exogene Faktoren
Es ist bekannt, dass die Zufuhr von Saccharose die Aktivität der Sucrase-Isomaltase erhöht. Dieser Anstieg ist das Ergebnis einer De-novo-Synthese des Enzyms, die 12 Stunden nach Beginn einer Saccharose-haltigen Diät ihren Höhepunkt (2,6-facher Anstieg) erreicht. Der Abbau des Enzyms ist unabhängig von der Ernährung.
Das Fasten behindert die Erneuerung der Darmepithelzellen. Es führt zu einer Verringerung der Dünndarmmasse, der Zottengröße und des Mitoseindex der Enterozyten in der Krypta. Kohlenhydratentzug führt zu einem Rückgang der intestinalen Sucrase, der durch Kohlenhydratfütterung wieder ausgeglichen wird.
Die DS-Werte variieren auch je nach Biopsieort. Dies gilt nicht nur für die Längsachse (Duodenum-Jejunum-Ileum) im Dünndarm, sondern auch für die Krypta-Villus-Achse. Da DS in die Mikrovilli der villösen Enterozyten eingebettet sind, hängt ihre Aktivität von der Anzahl der in der Biopsie vorhandenen villösen Enterozyten ab, so dass die oberflächlicheren Biopsien mit einem höheren Epithelgehalt einen höheren DS-Gehalt aufweisen können.
3.2. Ex-vivo- und In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Glutentoxizität bei Zöliakie
Es gibt kein Tiermodell, das alle Merkmale der Zöliakie reproduziert. In-vivo-Tests sind der Goldstandard für die Bewertung der Zöliakie-Toxizität. Es ist jedoch bekannt, dass die in vivo-Verabreichung von Gluten zu systemischen Schäden beim Patienten führen kann. Daher werden vor der Durchführung von In-vivo-Studien in der Regel In-vitro-Methoden angewandt, wenn es darum geht, Lebensmittel auf fehlende Zöliakie-Toxizität zu untersuchen.
Die zuverlässigste In-vitro-Methode ist die Dünndarmschleimhaut-Biopsiekultur, die auch als Duodenal-Biopsie-Organ-Kultur (OC) bezeichnet wird. Diese Methode wurde ursprünglich von Browning und Trier beschrieben. Da für präklinische In-vitro-Studien ein erheblicher Bedarf besteht, wurde das Prinzip der Methode von Browning und Trier weiterentwickelt und auf die Prüfung von Probiotika angewandt, die eine apikale Stimulation von Darmschleimhaut-Explantaten erfordert. OC ermöglicht verschiedene andere Anwendungen, z.B. biochemische Untersuchungen der Synthese und Verarbeitung von DS, der dimeren Zusammensetzung von DS und die Untersuchung der Auswirkungen von Insulin auf erhöhte DS-Aktivitäten bei Diabetikern.
Die ursprüngliche Methode von Browning und Trier wurde so modifiziert, dass das System schädliche Auswirkungen von Gluten nachweist, indem es dem Kulturmedium zugesetzt wird und die anschließenden histologischen, morphologischen und immunologischen Anomalien bewertet werden. Die modifizierte Browning- und Trier-Methode wird nach wie vor häufig in Studien zur Untersuchung der CD-Pathogenese und bei Tests auf Zöliakie-Toxizität eingesetzt. Das OC-System hat sich auch als nützlich erwiesen, um die Diagnose von CD zu unterstützen, vor allem in Fällen ohne Zottenatrophie oder bei seronegativen Patienten.
3.2.1. Frühe Arbeiten zur Kultur von Dünndarmorganen und zur Untersuchung von Bürstengrenzenzymen bei CD
Enterozytenschäden sind das Kennzeichen der Zöliakie. Die toxische Wirkung von Gluten auf die Dünndarmschleimhaut wurde biochemisch durch Messung der Aktivität des Bürstensaumenzyms alkalische Phosphatase (AP) in OC nachgewiesen. Die Aktivität der AP aus Biopsien von unbehandelten CD-Patienten stieg an, wenn das Gewebe in glutenfreiem Medium inkubiert wurde. Dieser Anstieg wurde durch das Vorhandensein von Glutenpeptiden im Kulturmedium gehemmt, was die toxische Wirkung von Gluten belegt.
Katz und Falchuk schlugen daraufhin die Verwendung der Dünndarm-OC-Technik als prädiktiven Test für die endgültige Diagnose einer Glutensensitivität vor. Zweiundzwanzig von 26 Patienten, bei denen CD diagnostiziert wurde, hatten bei ihren ersten Biopsien in vitro eine Glutensensitivität gezeigt. Ein Anstieg der AP-Aktivität von Darmgewebe dieser 22 Patienten wurde durch die Anwesenheit von Glutenpeptiden im Medium gehemmt. Die falsch-negative Rate für die Feststellung der Diagnose CD lag somit bei 15 % (4 von 26). In ihrer Studie gab es auch 14 Patienten mit abnormalen Schleimhäuten, bei denen sich herausstellte, dass sie keine CD hatten. Dreizehn von ihnen wiesen in vitro keine Glutensensitivität auf (eine falsch-positive Rate von 7 %). Alle Patienten mit normalen Biopsien wurden korrekt klassifiziert. Diese aufregenden Ergebnisse legen nahe, dass die Kultur von Dünndarmorganen für die prospektive Diagnose von CD verwendet werden könnte. In einer weiteren Studie wiesen Falchuk et al. erneut eine Glutensensitivität in vitro bei Patienten mit aktiver CD nach. Sie wiesen ferner darauf hin, dass es je nach Histokompatibilitätstyp der Probanden Unterschiede gibt.
Andere Forscher führten ähnliche OC-Studien durch, in denen sie die AP-Aktivität und ein anderes Bürstensaumenzym, die α-Glucosidase, maßen. Howdle et al. und Hauri et al. konnten die Auswirkungen von Gluten auf Duodenalbiopsien von unbehandelten CD-Patienten weder in vitro noch durch Messung der AP- oder α-Glucosidase-Aktivität reproduzieren.
Mitchell et al. zeigten, dass es während der OC zu einem fortschreitenden Verlust von Proteinen aus dem Gewebe kommt. Gleichzeitig sinken die Konzentrationen der Bürstengrenzenzyme und reichern sich im Medium an. Sie schlugen daher vor, die Enzymaktivitäten als mU/ml des Kulturmediums auszudrücken, im Gegensatz zu U/g Protein, aufgrund der Proteinverluste während der Organkultur und der wiedergewonnenen Enzymaktivitäten im Medium.
Mehrere Autoren untersuchten die Proteine, den DNA-Gehalt und die Bürstengrenzenzyme in Dünndarmbiopsien von OC. Die meisten haben eine Abnahme all dieser Parameter in kultivierten Biopsien beobachtet, mit Ausnahme der AP-Aktivität, die in praktisch allen Fällen zunahm. DS gehen während der Kultur wahrscheinlich leichter in das Medium verloren als AP.
3.2.2. Zellmodelle und Enzymaktivitäten
Neben der Dünndarmschleimhaut von CD-Patienten haben Forscher verschiedene Zelllinien für In-vitro-Studien von CD verwendet. Etablierte Zellmodelle basieren auf glutensensitiven T-Zelllinien und Klonen, die von Personen mit CD isoliert wurden und die immer noch in großem Umfang beim Screening auf CD-Toxizität eingesetzt werden. Auch mit Epithelzelllinien krebsartigen Ursprungs, die relativ leicht zu züchten sind, wurden bereits umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt. Es ist jedoch nicht geklärt, inwieweit sich die bösartige Umwandlung auf ihre mögliche Abhängigkeit von den Einflüssen der Mikroumgebung auswirkt. Es hat sich gezeigt, dass Dickdarmkrebs-Zelllinien im Gegensatz zu normalen Epithelzellen für ihre Expansion in vitro keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren benötigen. Darüber hinaus exprimieren Caco2-Zellen im Vergleich zu normalen Enterozyten deutlich geringere Mengen an Bürstengrenzenzymen.
Bevor Sato et al. ihre bahnbrechende Entdeckung über Darmorganoide veröffentlichten, waren Enterozyten in vitro bekanntermaßen schwer zu züchten. Im Laufe der Jahrzehnte wurde in vielen Studien über normales Darmepithel berichtet, dass es schwierig ist, die Kultur dieser Zellen länger als ein paar Tage aufrechtzuerhalten (und Verweise darin), obwohl unterschiedliche Isolierungsprotokolle und anschließende Kulturbedingungen verwendet wurden. Viele Jahre lang ging man davon aus, dass Langzeitkulturen aus primärem menschlichem Gewebe nicht angelegt werden können, es sei denn, die Zellen werden genetisch transformiert. Es wurde auch entdeckt, dass die Störung der Wechselwirkungen zwischen normalen Epithelzellen und der umgebenden extrazellulären Matrix die Apoptose der Zellen auslöst.
Quaroni et al. gelang es jedoch, eine Langzeitkultur von Dünndarmepithelzellen der Ratte anzulegen. Ihr anfänglicher Ansatz zur Isolierung entsprach dem der OC, aber die kultivierten Epithelzellen wiesen die Merkmale von undifferenzierten Dünndarmkryptazellen auf. In anderen Studien mit Darmbiopsien von Mensch, Maus, Ratte und Rind wurde ein geringer Differenzierungsgrad der kultivierten Enterozyten in vitro festgestellt, der mit unseren Beobachtungen übereinstimmt (unveröffentlichte Daten). Rusu et al. untersuchten die Differenzierung in vitro, indem sie die spezifischen Aktivitäten von Maltase und AP in Rinderproben von (a) frisch abgeschabten Epithelien, (b) Organoid-Suspensionen, die zur Aussaat von Kulturen verwendet wurden (nicht zu verwechseln mit den Organoiden von Sato), und (c) Darmzellkulturen, die primär kultivierte Zellen und Zellen nach der ersten und zweiten Passage umfassen, bewerteten. Organoidsuspensionen wiesen eine 50 %ige Reduktion im Vergleich zum frischen Epithelpräparat auf. Die Maltaseaktivität, die als Differenzierungsmarker verwendet wird, nahm in den Primärkulturen deutlich ab und erreichte mit den nachfolgenden Kulturpassagen ein stabiles niedriges Niveau. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei der Messung der intestinalen AP-Aktivität. Diese Ergebnisse spiegeln einen Verlust der Zelldifferenzierung in vitro wider.
Das Epithel ist nur eine (i) von vier Komponenten einer integrierten funktionellen Einheit, die auch aus (ii) extrazellulärer Matrix, (iii) von Mesenchym abgeleiteten Zellen und (iv) luminalen Faktoren besteht. Die Isolierung der Enterozyten aus ihrer mesenchymalen Umgebung führt zu einem Verlust der Differenzierung. Nicht transformierte humane fötale Dünndarmzellen, die auf Kunststoff gezüchtet werden, weisen Merkmale von undifferenzierten Krypto-Enterozyten auf. Die sequentielle Zugabe von Bindegewebs- und Luminalmolekülen zu nicht bösartigen menschlichen fötalen Enterozyten in vitro induzierte ein Spektrum von Veränderungen des Epithelzelltyps in Richtung einer vollständigen Differenzierung. Eine Dünndarmzelllinie der Ratte differenzierte sich ebenfalls, was sich in einer signifikanten Zunahme der Sucrase-Aktivität zeigte, wenn sie in Gegenwart von Mesenchym kultiviert wurde. Die normale Entwicklung und Differenzierung des Dünndarmepithels hängt also von der Interaktion mit Mesenchym und anderen Bestandteilen ab.
Langzeitkulturen normaler primärer menschlicher Epithelzellen, die aus dem Dünndarm isoliert wurden, sind inzwischen gut etabliert. Menschliche Epithel-„Minidärme“ können aus Darmkrypten und einzelnen Stammzellen gezüchtet werden. Es ist möglich, Organoidkulturen in vitro zu vermehren, die sowohl aus dem Maus- als auch aus dem menschlichen Darm stammen. Diese Organoide können unbegrenzt gezüchtet werden und weisen in Bezug auf Architektur, Zelltypen und Selbsterneuerungsmerkmale alle Merkmale des Dünndarmepithels auf.
Sato et al. definierten die Bedingungen, die die Proliferation und Differenzierung von Organoiden fördern. Sowohl die Stammzellen als auch die Organoide mussten in Matrigel eingebettet werden, einer laminin- und kollagenreichen Matrix, die die Basallamina nachahmt. Die Kultur des menschlichen Dünndarms ist komplexer als die des Mausdarmes. Zusätzlich zu R-Spondin, Noggin und dem epidermalen Wachstumsfaktor erfordern die für den Menschen optimierten Kulturbedingungen weitere Zusätze (Wnt3A, Gastrin, Nicotinamid, Alk-Inhibitor und p38-Inhibitor). Die Differenzierung von kultivierten humanen kleinen Epithelorganoiden in verschiedene Zelltypen des Darms erfordert den Entzug bestimmter Zusätze (Wnt3, Nicotinamid und p38-Inhibitor). Ein Differenzierungsmarker für reife Enterozyten wurde durch eine AP-Färbung der Bürstengrenze sichtbar gemacht. In einer anderen Studie ließen Middendorp et al. ebenfalls bestimmte Kulturzusätze weg, um eine Dünndarmdifferenzierung menschlicher Organoide zu erreichen. Interessanterweise funktionierte die Visualisierung reifer Enterozyten durch Sucrase-Isomaltase-Färbung bei Ileus-Organoiden gut, nicht aber bei Duodenalorganoiden. Die Expression von Laktase wurde sowohl in ilealen als auch in duodenalen Organoiden durch das sogenannte Differenzierungsmedium induziert.
3.2.3. Jüngste Fortschritte in der Intestinalorganoid-Methode
Die Organoid-Technologie könnte bei der regenerativen Therapie einiger Darmerkrankungen durch Ex-vivo-Expansion der Darmepithelien und Transplantation Anwendung finden. Diese Methode ermöglicht auch die In-vitro-Vermehrung von erkranktem Magen-Darm-Gewebe, was die Pathogenese der Krankheit und die Entwicklung von Therapien aufklären könnte. Intestinale Organoide wurden bereits zur Modellierung von monogenen Krankheiten, die das Epithel betreffen, von entzündlichen Darmerkrankungen (Untersuchung des Zelltods, der Integrität der Schleimhaut und der Auswirkungen von Entzündungszytokinen), von Wechselwirkungen zwischen Darmgewebe und Mikroben sowie von Krebs verwendet (und Verweise darin). Die CD-Forschung hinkt diesen Fortschritten hinterher. Es ist bekannt, dass viele Zelltypen an der Pathogenese von CD beteiligt sind, und daher fehlen in Organoiden viele der Zelltypen, die in einem In-vivo-System vorhanden sind. Die Komplexität kann jedoch durch Kokultur mit Immunzellen erhöht werden. Nozaki et al. beschrieben die Kokultur von murinen Organoiden und intraepithelialen Lymphozyten (IELs), bei der sowohl αβT- als auch γδT-Zellen erfolgreich proliferierten und genauso beweglich waren wie IELs, die in vivo vorkommen. Kokulturen von Organoiden wurden auch für das enterische Nervensystem und Myofibroblasten beschrieben.
Aufgrund der Fortschritte bei serologischen und genetischen Tests in der Zöliakie-Diagnostik ist die Duodenalbiopsie bei vielen Patienten möglicherweise nicht mehr erforderlich. Folglich wird das Biopsiematerial knapp werden. Darmorganoide können jedoch auch aus embryonalen Stammzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden (und Verweise darauf), die zwar länger dauern und technisch anspruchsvoller und kostspieliger sind als aus Biopsie gewonnene Organoide, aber die Anzahl der resultierenden Organoide erheblich erhöhen und es ermöglichen, das klinische Material stattdessen für die Züchtung der Immunzellen zu verwenden.
3.2.4. Bedeutung der Arbeit mit intestinalen Organoiden und Bürstengrenzenzymen für die Entwicklung moderner In-vitro-Methoden für die CD-Forschung
Es ist bekannt, dass angeborene und adaptive Immunreaktionen in der CD-Pathogenese ausgelöst werden; die genaue Abfolge dieser pathologischen Ereignisse ist jedoch bis heute nicht geklärt worden. Die Organoidtechnologie ermöglicht jedoch die sequentielle Zugabe der Zellen in die Kokultur und damit die Untersuchung der angeborenen Immunantwort durch die Rekonstitution von Zöliakie-Organoiden und IELs getrennt von den Auswirkungen einer adaptiven Immunantwort. Glutenspezifische T-Zellen, die ebenfalls in vitro gezüchtet werden können, können dann in dieses In-vitro-Modell der CD einbezogen werden, um die vollständigen toxischen Auswirkungen von Gluten auf das Darmepithel zu untersuchen.
Die Organoidtechnologie ermöglicht es auch, die Rolle der Enterozyten bei der Verarbeitung von Gliadinpeptiden bei der CD zu klären. Enterozyten haben die Fähigkeit, als antigenpräsentierende Zellen zu fungieren, wobei die Stimulation von T-Zellen durch ihre HLA-DR-Moleküle vermittelt wird. Außerdem enthält Gliadin Peptide, die eine angeborene Immunreaktion auslösen können. Interessanterweise wird das Glutenpeptid, das die angeborene Immunität bei Zöliakie auslöst, innerhalb des Enterozyten anders verarbeitet als die Peptide, die eine adaptive Immunantwort auslösen, bei der die Peptide HLA-DR-positive späte Endosomen erreichen und den T-Zellen der Lamina propria präsentiert werden. Da die Schädigung des Bürstensaums der Enterozyten eine der frühesten Veränderungen bei CD ist, könnte DS zur Untersuchung der toxischen Auswirkungen von Gluten bei CD verwendet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Bürstensaumenzyme ein integraler Bestandteil der reifen Zotten-Enterozyten sind und quantitativ mit ihrer Differenzierung zusammenhängen. Die DS-Aktivität korreliert jedoch möglicherweise nicht mit der Lebensfähigkeit der Enterozyten, da die Aktivitäten der Bürstensaumenzyme auch in nicht lebensfähigen Epithelzellen nachgewiesen wurden. Daher könnte die Immunfärbung oder, genauer gesagt, das Fehlen der Immunfärbung für Bürstensaumenzyme aufgrund der Zerstörung der Mikrovilli als Marker für die CD-Pathogenese verwendet werden.
Organoidtechnologie hat ein erhebliches Potenzial für die Krankheitsmodellierung und damit für die Aufklärung der Abfolge pathogener Ereignisse bei CD, bei denen Bürstensaumenzyme genutzt werden können. Neue In-vitro-Modelle, die auf den jüngsten Fortschritten in der Stammzellenforschung beruhen, könnten die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei CD erleichtern.
4. Schlussfolgerungen
Die Struktur der Dünndarmschleimhaut und die beteiligten physiologischen Prozesse sind sehr komplex. CD erhöht diese Komplexität, da viele Komponenten des Darms, einschließlich DS, betroffen sind. Obwohl DS-Aktivitäten früher eine wichtige Rolle bei der Diagnose von CD gespielt haben, ist die Anwendung von DS-Aktivitäten in der In-vitro-Forschung bei CD noch nicht etabliert. Die jüngsten Fortschritte bei der Ex-vivo-Züchtung von Epithel-„Mini-Eingeweiden“ stellen eine aufregende neue Plattform dar, die jetzt verfügbar ist. Sie ermöglicht es, normales oder krankes Epithel mit Hilfe von Tissue Engineering zu untersuchen. Epithelzellen wachsen und differenzieren unter definierten Bedingungen, zu denen das Vorhandensein einer extrazellulären Matrix und von Wachstumsfaktoren gehört. Eine sich selbst erneuernde Population von Epithelzellen exprimiert Bürstengrenzenzyme, die bei In-vitro-Untersuchungen von CD eingesetzt werden könnten, wenn andere Immunzellen in das Modell integriert werden.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Die Autoren möchten Dr. H. Julia Ellis für hilfreiche Diskussionen und die Durchsicht des Manuskripts danken. Tanja Šuligoj dankt dem Clinical Research Trust für die Unterstützung. Borut Božič bedankt sich für die teilweise finanzielle Unterstützung durch die Slowenische Wissenschaftsstiftung, Grant no. SZF-BBozic01/2007.