Der klonogene Assay wurde in zahlreichen Studien zur Quantifizierung des klonogenen Wachstums und seiner Aufhebung durch zytotoxische Stimuli, einschließlich Strahlung, chemotherapeutische Medikamente und/oder molekular gezielte Wirkstoffe, in vitro verwendet. Das derzeitige Standardverfahren zur Bestimmung der Überlebensfraktionen basiert auf der Annahme, dass das klonogene Wachstum in behandelten Zellkulturen durch Teilung durch eine zelllinienspezifische, konstante PE auf die unbehandelten Kontrollen normalisiert werden kann.
Wir zeigen jedoch, dass dies nicht universell anwendbar ist. Im Gegenteil, unsere Daten zeigen deutlich, dass die Korrelation zwischen der Anzahl der in einer Kulturschale ausgesäten Zellen und der Anzahl der erhaltenen Kolonien keineswegs immer linear ist. Bei Zelllinien mit kooperativem Verhalten führte die PE-basierte Analyse der klonogenen Überlebensdaten zu Ergebnissen mit großen bis enormen assay-immanenten Fehlern. Selbst wenn nur Kulturschalen mit einer angemessenen Anzahl von Kolonien (C = 5 bis 100) für die Analyse verwendet wurden, unterschieden sich die klonogenen Überlebensanteile bei einer bestimmten Dosis um weit mehr als eine Größenordnung für Zelllinien mit einem hohen Grad an zellulärer Kooperation. Bemerkenswert ist, dass praktisch jede Überlebenskurve (steil oder flach, mäßig oder stark gekrümmt, linear, quadratisch oder unregelmäßig) aus diesem Bereich von Ergebnissen, die aus dem gegebenen Datensatz berechnet wurden, abgeleitet werden kann – eine Beobachtung, die für Strahlenbiologen von besonderer Bedeutung sein könnte.
Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die konventionelle PE-basierte Analyse klonogener Überlebensdaten ungeeignet ist, sobald unter einer oder mehreren Bedingungen innerhalb eines Experiments zelluläre Kooperation auftritt, und dass die extrahierten Überlebensergebnisse in einem unbefriedigend großen Bereich variieren. Insbesondere werden die Ergebnisse stark verzerrt, wenn nur eine oder wenige ähnliche Zelldichten plattiert werden. Diese Praxis führt zu Assay-immanenten Fehlern, die eine direkte Folge der gewählten Zelldichten sind und sich daher nicht für statistische Fehleranalysen eignen. Bei kooperativ wachsenden Zelllinien können unsere Beobachtungen teilweise die gemeldeten Inkongruenzen zwischen den Tests, Forschern und Laboren in Bezug auf die Daten zum Ansprechen auf die Behandlung erklären. Eine Meta-Analyse der Daten des A549-Koloniebildungstests unterstützt diese Hypothese weiter: Innerhalb eines Panels von 156 verschiedenen Studien berichteten Nuryadi et al. über SF4-Werte für diese spezifische Zelllinie, die von 5 bis 90 % mit einem SF4-Interquartilsbereich von mehr als 25 % reichten. Obwohl diverse andere Parameter die Daten zum Ansprechen auf die Behandlung beeinflussen können, schließen wir aus unseren Daten, dass die zelluläre Zusammenarbeit ein wichtiger Faktor ist, der die Variabilität zwischen den Studien erklärt. Da selbst kleine Unterschiede in den klonogenen Überlebensanteilen Forscher dazu verleiten können, neue wissenschaftliche Hypothesen aufzustellen und zu untersuchen, die möglicherweise auf falscher Präzision beruhen, haben wir einen neuartigen Analyseansatz entwickelt, der weniger anfällig für die Auswirkungen der Zelldichte ist – insbesondere, aber nicht nur für kooperativ wachsende Zelllinien. Diese Methode berücksichtigt nichtlineare Beziehungen zwischen der Anzahl der ausgesäten Zellen und der Anzahl der Kolonien, die durch die Auswertung von Kulturschalen mit einem breiten Spektrum an ausgesäten Zellen für alle Behandlungsbedingungen erhalten werden.
Mathematisch gesehen nutzt unser Ansatz die Potenzregression und die Interpolation der übereinstimmenden Anzahl von Kolonien bei verschiedenen Bestrahlungsdosen. Angewandt auf denselben Datensatz, der für die PE-basierten Berechnungen verwendet wurde, liefert er deutlich stabilere, von der Zelldichte unabhängige Ergebnisse. Aufmerksamen Lesern ist vielleicht aufgefallen, dass die Berechnungen des Überlebensanteils, die nach der hier vorgestellten Methode durchgeführt wurden, ausschließlich auf dem Koeffizienten a und dem Exponenten b beruhen, die durch Potenzregression extrahiert wurden. Damit werden zwar die Auswirkungen der zellulären Kooperation kompensiert, doch ist dies mit einer anderen Fehlerqualität behaftet, die sich aus der Ungenauigkeit der Regression ergibt und quantitativ nicht mit der ähnlichen Fehlerqualität bei PE-basierten Überlebensfraktionsberechnungen verglichen werden kann. Daher sollte dieser Fehler durch eine sorgfältige Versuchsplanung mit einer ausreichenden Anzahl unabhängiger Wiederholungen minimiert werden. Außerdem sollten Überlebensfraktionsberechnungen nur mit Power-Regressionsergebnissen durchgeführt werden, die eine angemessene Leistung aufweisen, wie sie durch den Regressionskoeffizienten R angezeigt wird.
Unser mathematischer Ansatz ersetzt die PE-basierten klonogenen Überlebensberechnungen im Wesentlichen durch die Frage:
Wie viele Zellen müssen in eine behandelte Kulturschale ausgesät werden, um die gleiche Anzahl von Kolonien wie in einer Kontrollschale zu erhalten?
Der Exponent b ist in diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung. Er gibt an, ob die Korrelation zwischen der Anzahl der ausgesäten Zellen und der Anzahl der gezählten Kolonien linear ist (b ≈ 1) oder nicht. Hohe b-Werte, wie sie für BT20- und SKLU1-Zellen ermittelt wurden, deuten darauf hin, dass das Zellwachstum in vitro verlangsamt (oder gänzlich aufgehoben) wird, wenn das Volumen des Kulturmediums pro Zelle erhöht wird – entweder durch Verwendung großer Testvolumina oder durch Verringerung der Anzahl der ausgesäten Zellen. Es ist zu betonen, dass die b-Werte keineswegs spezifisch für eine bestimmte Zelllinie sind, sondern vielmehr eine Folge des gewählten Zellkulturmediums, verschiedener Test-Inkubationsparameter und des Versuchsablaufs, einschließlich praktisch aller Aspekte, die das klonale Wachstum von Zellen beeinflussen könnten, die sich in einer extremen Stresssituation befinden, wenn sie als Einzelzellen ausgesät werden, wie z. B. die Formulierung des Mediums, die Ergänzung mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren, die für die Zellseparation verwendeten Methoden, die Kunststoffgeräte usw. Die Verwendung von konditionierten Medien aus nahezu konfluenten BT20-Zellen schwächte beispielsweise das kooperative Verhalten von BT20-Einzelzellen stark ab, während dieses Verfahren keine Auswirkungen auf das klonogene Wachstum von nicht kooperativ wachsenden MDA-MB231-Zellen hatte. Darüber hinaus war die Verdopplungszeit kooperativer BT20-Zellen sowohl von der Inkubationszeit des Assays als auch von der Zelldichte in der Vertiefung abhängig, was eine selbstverständliche biologische Erklärung für die ungenauen klonogenen Überlebensanteile liefert, die durch PE-basierte Berechnungen ermittelt wurden: Die Wachstumsrate eines proliferierenden Zellhaufens kann einfach zu langsam sein, um den Schwellenwert von 50 Zellen pro Kolonie innerhalb der Inkubationszeit des Assays zu erreichen. Daher ist die scheinbare „Nicht-Klonalität“ eines Clusters von z. B. 35 langsam proliferierenden Zellen zum Zeitpunkt des Stopps lediglich eine unvermeidliche Folge der – zumindest bis zu einem gewissen Grad – willkürlich gewählten Assay-Inkubationszeit. In diesem Zusammenhang haben wir zusätzlich die Auswirkung der Inkubationszeit auf die erhaltenen klonogenen Überlebensfraktionen analysiert und festgestellt, dass es nicht ausreicht, den Stoppzeitpunkt allein durch die Inspektion der Kontrollschalen zu bestimmen, wie es von anderen vorgeschlagen wurde: Eine vorzeitige Beendigung der Inkubationszeit kann zu extrem niedrigen Überlebensfraktionen auf Platten mit aggressiverer Behandlung führen, wo die Schadensbehebung vor der Fortsetzung des Zellwachstums zusätzliche Zeit erfordert.
Wichtig ist, dass unsere Daten voll und ganz mit den bahnbrechenden Erkenntnissen von Zellkulturforschern in den 40er und 50er Jahren übereinstimmen und einfach ein Phänomen widerspiegeln, das zu dieser Zeit umfassend untersucht wurde. Puck und Kollegen waren die ersten, die 1956 eine Überlebenskurve von bestrahlten Einzelzellen veröffentlichten. Die größte wissenschaftliche Herausforderung für diese grundlegende Errungenschaft war jedoch ein damals ungelöstes Problem der Säugetierzellkultur: Zelllinien hörten auf, in vitro zu wachsen, sobald die Zellen in geringer Dichte vermehrt wurden. Ein Versuch, dieses Problem zu überwinden, wurde 1948 von Sanford et al. unternommen, denen es gelang, aus einzelnen Zellen gewonnene Fibroblastenkolonien in kleinen Kapillaren zu züchten, in denen die Diffusion von aus den Zellen gewonnenen Faktoren in das Medium stark reduziert war, so dass eine ausreichende autokrine Wachstumsstimulation möglich war. Sie wiesen auf die Bedeutung der Vorkonditionierung des Nährmediums durch die kultivierten Zellen hin und kamen zu dem Schluss, dass ein Zellkulturmedium, das ein unbegrenztes Wachstum von Zellkulturen mit hoher Dichte ermöglicht, in der Tat „bei weitem nicht optimal für das Wachstum einer einzelnen Zelle“ ist. Im Einklang damit beschrieben Earle et al., dass das Ausplattieren des jeweiligen Zelltyps bei sehr geringer Dichte zum Zelltod führt, und diese Arbeit bildete die Grundlage für die erste Veröffentlichung über klonogenes Wachstum von Säugetierzellen in vitro durch Puck und Marcus im Jahr 1955. Inspiriert durch den Bedarf an konditioniertem Kulturmedium zur Erleichterung des Einzelzellwachstums verwendeten sie ein Co-Kultursystem aus HeLa-Einzelzellen und einer Schicht stark bestrahlter Feederzellen desselben Typs. In Übereinstimmung mit den vorangegangenen Studien kamen sie zu dem Schluss, dass die Hemmung des Einzelzellwachstums in großen Versuchsvolumina auf den „Verlust eines kurzlebigen, diffusionsfähigen Faktors“ zurückzuführen ist. In späteren Veröffentlichungen, wie z. B. der ersten Überlebenskurve von bestrahlten Säugetierzellen, verzichteten Puck und Kollegen häufig auf die Verwendung von Feederschichten, da sie fortschrittliche Kulturtechniken entwickelt hatten, die ein Einzelzellwachstum mit 100 % PE ohne Wachstumsfaktorsupplementierung durch Feederzellen ermöglichten. Sie stellten fest, dass sorgfältige Wasch- und Trypsinisierungsprotokolle in diesem Zusammenhang unerlässlich sind, und prägten den Begriff „kooperative Aktion“, um zu beschreiben, dass sich die Zellen in einer Kulturschale sowohl hinsichtlich des Genotyps als auch des physiologischen Zustands unterscheiden können. Unsere Ergebnisse rekapitulieren diese Beobachtungen: Innerhalb eines Panels von 50 Krebszelllinien beobachteten wir, dass suboptimales Wachstum einzelner Zellen in modernen, standardisierten Kulturmedien, die mit FCS ergänzt wurden, immer noch ein sehr häufiges Phänomen ist, wie aus der Feststellung abgeleitet werden kann, dass mehr als die Hälfte der Zelllinien kooperatives Wachstumsverhalten zeigten. Wenn also für eine bestimmte Zelllinie suboptimale PEs gefunden werden, ist es wahrscheinlich, dass der klonogene Assay gleichzeitig sowohl den Einfluss der interessierenden Behandlung als auch die Auswirkungen der zellulären Kooperation erfasst. Es war nicht Aufgabe dieser Studie, spezifische wachstumsfördernde Faktoren zu identifizieren, die die PE der untersuchten Zelllinien beeinflussen könnten. Wir stellen jedoch die Hypothese auf, dass suboptimale Wachstumsbedingungen für einzelne Zellen einer bestimmten Zelllinie aus sehr unterschiedlichen Parametern resultieren können, wie z. B. niedrigen Konzentrationen klassischer Wachstumsfaktoren und/oder Hormone (z. B. epidermaler Wachstumsfaktor oder Östrogen), aber auch verschiedenen nieder- und hochmolekularen Metaboliten, für die zumindest ein Teil der einzelnen Zellen Auxotrophie zeigt. Darüber hinaus wird die Nährstoffzufuhr einzelner Zellen in einer Kulturschale wahrscheinlich durch physikochemische Parameter des umgebenden Mediums und des Kunststoffs beeinflusst, einschließlich des Grads der Proteinbindung der jeweiligen auxotrophen Faktoren oder ihrer Adsorption an der Kunststoffoberfläche. Theoretisch könnte dieses Problem durch Maßnahmen angegangen werden, die den maximalen PE-Wert bei niedriger Dichte wiederherstellen, so dass eine lineare Korrelation zwischen S und C (wieder) hergestellt wird (b = 1). Pucks Empfehlungen für die Verwendung von Feeder-Zellen, konditionierten Medien und/oder die Einbettung einzelner Zellen in Weichagar könnten ausreichen, um dies für ausgewählte Zelllinien zu erreichen, und sollten die Robustheit der PE-basierten Berechnungen entsprechend erhöhen. Es liegt jedoch auf der Hand, dass es mehr als schwierig sein kann, die Testbedingungen so zu verfeinern und zu standardisieren, dass die Überlebens- und Wachstumsraten der einzelnen Zellen für jeden einzelnen Zelltyp von Interesse optimal sind. Wir haben uns entschlossen, suboptimale Testbedingungen für das Einzelzellwachstum zu akzeptieren und stattdessen eine Berechnungsmethode für die Analyse klonogener Überlebensdaten zu entwickeln, die dieses gut beschriebene Phänomen berücksichtigt. Offensichtlich lag unser Ansatz, der Potenzregression und Interpolation verwendet, jenseits der technischen Möglichkeiten der 1950er Jahre, als Überlebensdaten nach Augenmaß angepasst wurden. In den folgenden Jahrzehnten geriet die Bedeutung der zellulären Zusammenarbeit jedoch irgendwie aus dem Blickfeld. Obwohl im Laufe der Zeit einige Berichte über die Nichtlinearität von Koloniebildungstests veröffentlicht wurden, wurde die begrenzte Leistung von PE-basierten Analysen nicht angesprochen.
Interessanterweise berichteten diese Studien über einen weniger als linearen Anstieg der Koloniezahlen mit zunehmender Anzahl der ausgesäten Zellen für bestimmte Zelltypen unter bestimmten Bedingungen. In Übereinstimmung damit erhielten wir für einige Zelllinien in unserem Panel auch b-Werte von knapp unter 1,0. Drei verschiedene Szenarien können diese Beobachtung erklären, von denen zwei auf methodische Artefakte zurückzuführen sind: Erstens können b-Werte leicht unter 1,0 aus der Zählung von Vertiefungen mit einer großen Anzahl überwachsener Kolonien resultieren, bei denen kleine Kolonien vom Forscher übersehen werden (siehe mit „nd“ markierte Vertiefungen in Abb. 1a). Zweitens kann das Zellwachstum in Schalen mit hohen Zellzahlen durch einen raschen Abfall der Nährstoffkonzentration in einem relativ frühen Stadium gehemmt werden, was zu abortiven Kolonien führt. Eine dritte – und biologisch weniger intuitive – Möglichkeit ist das Konkurrenzverhalten des Zellwachstums, zum Beispiel durch die Sekretion wachstumshemmender Faktoren. Wichtig ist, dass jedes dieser Phänomene durch den Regressions- und Interpolationsansatz berücksichtigt wird, da er jede Abweichung von der Linearität berücksichtigt, die sich im b-Wert widerspiegelt.
Außerdem ist es bemerkenswert, dass die b-Werte verschiedener Zelllinien für unbehandelte im Vergleich zu bestrahlten Bedingungen nicht identisch sind. In den meisten dieser Fälle sind die b-Werte der bestrahlten Zellen tendenziell höher als die entsprechenden b-Werte der unbehandelten Kontrollen, was darauf hindeutet, dass die zelluläre Kooperation bei Bestrahlung zunimmt. Infolgedessen wird der Bereich der Überlebensfraktionswerte, die für C = 5 bis 100 Kolonien erhalten werden, breiter als im Falle nahezu identischer b-Werte (siehe Zelllinien HCC1806 und A549). Dies bedeutet, dass es technisch nicht möglich ist, genauere Überlebenswerte mit Hilfe des klonogenen Assay-Verfahrens zu extrahieren, es sei denn, es wurde eine feste Anzahl von Kolonien (C) für die Analyse ausgewählt. Darüber hinaus können Zelllinien mit überdurchschnittlich hohen b-Werten für behandelte Zellen von besonderem Interesse für Therapieresistenzstudien sein. So könnten beispielsweise strahleninduzierte Überlebensfaktoren, die von einem bestimmten Zelltyp sezerniert werden, aufgrund eines entsprechend hohen b-Wertes identifiziert werden.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten die Notwendigkeit, Daten aus Koloniebildungsexperimenten sorgfältig zu analysieren und den unterschätzten Einfluss der zellulären Kooperation auf die Berechnung der Überlebensfraktion zu berücksichtigen. Dies kann die Zuverlässigkeit des klonogenen Assays – und die Belastbarkeit jeder darauf basierenden Hypothese – erheblich erhöhen.