Bakterielle Zellmembranaktivitäten von PHMB
Wenn die antibakterielle Aktivität von PHMB (Abb. 1a) auf einer Störung der Zellmembran beruht, wie vielfach berichtet6,7,8,9,10, würde man erwarten, dass es bei wachstumshemmenden und weniger wachstumshemmenden Konzentrationen die bakteriellen Zellbarrieren durchdringt. 1a) auf die Zerstörung von Membranen zurückzuführen ist, wie vielfach berichtet6,7,8,9,10, würde man erwarten, dass es die bakteriellen Zellbarrieren bei wachstumshemmenden und subwachstumshemmenden Konzentrationen durchlässig macht. Um dieses Modell zu testen, haben wir zunächst die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) und die zeitlichen Abtötungseigenschaften von PHMB gegen Escherichia coli (Stämme K-12 und MG1655) und Salmonella enterica serovar Typhimurium (Stamm LT2) bestimmt. Wie bereits berichtet2,4, zeigte PHMB starke wachstumshemmende und abtötende Eigenschaften (ergänzende Tabelle 2 und ergänzende Abb. 1). Nach der Behandlung untersuchten wir die Zellen auch mit Hilfe der Lichtmikroskopie. Unerwarteterweise führten wachstumshemmende Konzentrationen von PHMB nicht zur Lysierung von Zellen, wie mit der Hellfeldmikroskopie festgestellt werden konnte. Zur Bewertung von Zellbarriereschäden, die für die Mikroskopie unsichtbar sein könnten, wurden E. coli K-12-Kulturen bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, mit PHMB in Gegenwart der fluoreszierenden Membranintegritätssonde SYTOX®Green behandelt und dann mittels Fluorimetrie überwacht. Diese Sonde ist ein nützlicher Indikator für Membranschäden, da sie normalerweise von intakten Bakterien ausgeschlossen wird und ihre Fluoreszenzquantenausbeute bei DNA-Bindung ansteigt. Daher ist zu erwarten, dass intakte Bakterien eine geringe Fluoreszenz aufweisen und dass die Fluoreszenz nach einer Schädigung der Zellbarriere zunimmt16. Wie erwartet, zeigten frisch gezüchtete E. coli-Kulturen einen starken Anstieg der Fluoreszenz nach Behandlung mit dem bekannten Zellwandzerstörer Polymyxin B oder nach Wärmebehandlung (Abb. 1b). Unerwarteterweise führte die Behandlung mit PHMB zu vergleichsweise niedrigeren Fluoreszenzwerten. Am auffälligsten ist, dass höhere Konzentrationen von PHMB zu einer Fluoreszenz auf Hintergrundniveau führten. Diese Beobachtungen sind nicht mit der Zerstörung von Membranen als wichtigstem antibakteriellen Mechanismus vereinbar und wecken daher weitere Zweifel an dem etablierten Modell.
PHMB-Wirkungen auf die Permeabilität der Zellmembran und das Eindringen in Bakterien.
(a) Struktur von Polyhexamethylenbiguanid (PHMB; CAS# 27083-27-8); alternative chemische Bezeichnungen: Polyhexanid; Handelsnamen: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Weitere Einzelheiten sind der ergänzenden Tabelle 1 zu entnehmen. PHMB besteht aus sich wiederholenden basischen Biguanidineinheiten, die durch Hexamethylenkohlenwasserstoffketten verbunden sind und eine kationische und amphipathische Struktur mit einer hohen Kapazität für Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen bilden. PHMB-Zubereitungen umfassen typischerweise Polymere gemischter Länge mit Amin-, Guanidin- und Cyanoguanidin-Endgruppen (z.B. durchschnittliches n = 13,8, 3.035 g/mol44) (b) Auswirkungen von PHMB, Wärme, Polymyxin B (Positivkontrolle) und Triclosan (Negativkontrolle) auf die Zellpermeabilität für SYTOX®Green. Die MHK-Werte für die getesteten Antibiotika sind oben mit farbkodierten vertikalen Pfeilen angegeben. (c) Fluoreszenzmikroskopie des Eintritts von PHMB-FITC in verschiedene Bakterien. PHMB-FITC (2 μg/mL) wurde zu Bakterienkulturen gegeben und die Zellen wurden mit DAPI gegengefärbt. (d) Konfokales Bild, das die Lokalisierung von PHMB-FITC (grün) in B. megaterium zeigt; die Bakterien wurden mit der membranlokalisierenden Sonde Weizenkeimagglutinin (WGA), konjugiert mit Alexa Fluor-555 (rot), gegengefärbt und als lebende (oben) und fixierte (unten) Zellen dargestellt; Balken = 5 μm. (e) Fluoreszenzprofilanalyse der zellulären Lokalisierung von PHMB-FITC- und WGA-Fluoreszenz (die weiße Linie zeigt den für die Analyse verwendeten Querschnitt). Die grüne Linie zeigt den Gehalt an FITC und die Position (hauptsächlich innerhalb der Zelle) an. Die rote Linie zeigt den Gehalt an WGA und die Position (hauptsächlich innerhalb der Membran) an.
PHMB dringt in Bakterien ein
Wenn das primäre Ziel von PHMB nicht die bakteriellen Zellbarrieren oder nicht ausschließlich die Zellbarrieren sind, dann wirkt es wahrscheinlich intern und dies würde ein Eindringen in die Zelle erfordern. Um das Eindringen von Bakterien zu testen, synthetisierten wir ein PHMB-FITC-Konjugat (ergänzende Abb. 2a,b) und untersuchten die Aufnahme in grampositive (Staphylococcus aureus), gramnegative (Escherichia coli und Salmonella enterica serovar Typhimurium) und säurefeste (Mycobacterium smegmatis) Bakterien mittels Mikroskopie und Durchflusszytometrie (Abb. 1c, ergänzende Abb. 3). Bei allen getesteten Arten wurde eine starke zellassoziierte grüne Fluoreszenz beobachtet (Abb. 1c). Um die Zelllokalisierung genauer zu untersuchen, wurde das großwüchsige Bakterium Bacillus megaterium mit PHMB-FITC behandelt, mit membranlokalisierendem Weizenkeimagglutinin (WGA-rot) gegengefärbt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht (Abb. 1d). Der Zelleintritt wurde sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen beobachtet, und eine Analyse des Fluoreszenzintensitätsprofils zeigt, dass PHMB-FITC im Zytoplasma lokalisiert war, ohne sich an der Zellbarriere anzusammeln (Abb. 1e).
Die Beobachtung, dass PHMB bereits bei niedrigen Mikrogramm/ml-Konzentrationen in Zellen eintritt, lässt vermuten, dass es in lebende Zellen gelangen kann. Um zu untersuchen, ob die Aufnahme von PHMB in Bakterien einen Energiestoffwechsel erfordert, wurden E. coli-Kulturen in der mittleren Log-Phase bei 37 °C oder bei 4 °C für 2 Stunden inkubiert, um den zellulären ATP-Spiegel zu senken. Anschließend wurden die Zellen mit PHMB-FITC (0-6 μg/ml) behandelt und weitere 2 Stunden auf Eis bebrütet. Die zellassoziierte PHMB-FITC-Fluoreszenz wurde mittels Fluorimetrie quantifiziert (ergänzende Abb. 3b). Zellen, die bei 4 °C gehalten wurden, zeigten eine geringere PHMB-FITC-Aufnahme im Vergleich zu Zellen, die bei 37 °C inkubiert wurden, was auf einen energieabhängigen Aufnahmeprozess der Zellen hindeutet. Außerdem wurden während der PHMB-Behandlung zu verschiedenen Zeitpunkten grün fluoreszierende und bewegliche Bakterien beobachtet (ergänzende Abb. 3). Da die bakterielle Motilität energieabhängig ist17 , deutet dies darauf hin, dass PHMB-FITC in metabolisch aktive Zellen gelangt. Daher dringt PHMB in verschiedene Bakterien ein, und der Eintritt wurde in beweglichen Zellen beobachtet.
PHMB stoppt die Zellteilung und kondensiert bakterielle Chromosomen
Bei der mikroskopischen Untersuchung von E. coli stellten wir fest, dass die mit PHMB behandelten Zellen häufig eine längliche Morphologie aufwiesen, die für eine Hemmung der Zellteilung charakteristisch sein kann (Abb. 2a). Um die Auswirkungen von PHMB auf die Zellstreckung zu messen, titrierten wir PHMB in wachsende Kulturen des E. coli-Stamms SS996 (vide infra) und maßen die Zelllängen. Bei wachstumshemmenden Konzentrationen streckten sich mehr als 80 % der Zellen (Abb. 2b; ergänzende Tabelle 2). Außerdem beobachteten wir, dass E. coli, die mit wachstumshemmenden Konzentrationen von PHMB oder PHMB-FITC und anschließender DAPI-Färbung behandelt wurden, blau fluoreszierende Foci in der Nähe des Zellzentrums aufwiesen (Abb. 2c). Diese Strukturen ähnelten Nukleoiden18. Um die Visualisierung der DNA-Foci zu erleichtern, erzeugten wir filamentöse/multinukleierte Populationen von E. coli, indem wir die Zellteilung durch RNA-Silencing des essenziellen Zellteilungsgens ftsZ hemmten19. Das RNA-Silencing wurde für dieses Experiment ausgewählt, weil es eine spezifische und kontrollierbare Unterdrückung der Translation essenzieller Gentranskripte ermöglicht20. Wachstumsrelevante Gene können nicht durch Genom-Disruptionsmethoden ausgeschaltet werden, da dies zu nicht lebensfähigen Stämmen führen würde. In Abwesenheit von PHMB zeigten fadenförmige Zellen eine einheitliche DAPI-Färbung, während mit PHMB behandelte Zellen blaue „Perlenschnüre“ aufwiesen (Abb. 2d). In ähnlicher Weise beobachteten wir bei dem großen grampositiven Bakterium B. megaterium DAPI-gefärbte Foci nach der Behandlung mit PHMB (Abb. 2e). Diese Ergebnisse, sowohl bei Gram-negativen als auch bei Gram-positiven Arten, zeigen, dass die PHMB-Exposition zu kondensierten Chromosomen in Bakterien führt.
PHMB-vermittelte Zelldehnung und Chromosomenkondensation in Bakterien.
(a) E. coli wurde 90 Minuten lang mit PHMB behandelt und mittels Hellfeldmikroskopie untersucht. (b) Mittlere Zelllänge in Abhängigkeit von der PHMB-Konzentration. Die MHK (Pfeil) ist angegeben. (c) Muster der Chromosomenverteilung in Zellen nach PHMB-FITC-Behandlung. Kulturen von E. coli, Stamm K-12, wurden mit PHMB-FITC behandelt, mit DAPI gegengefärbt und mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Chromosomen erscheinen als kondensierte, mit DAPI gefärbte Foci, die in der vergrößerten Abbildung deutlicher zu erkennen sind. (d) Muster der Chromosomenverteilung in filamentösen/multinukleierten E. coli nach PHMB-Exposition. Die RNA-Silencing der ftsZ-Expression wurde verwendet, um die Zellteilung zu stoppen, und die Zellen wurden dann unbehandelt oder mit PHMB behandelt, mit DAPI angefärbt und mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. (e) Muster der Chromosomenverteilung in B. megaterium-Zellen, die unbehandelt oder mit PHMB behandelt, mit DAPI und WGA-rot angefärbt und mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht wurden.
PHMB-vermittelte antibakterielle Wirkungen sind unabhängig von Stressreaktionswegen
Zelldehnung und Chromosomenkondensation sind charakteristische Morphologien, die häufig mit der bakteriellen SOS-Reaktion in Verbindung gebracht werden21,22. Daher gingen wir davon aus, dass diese Effekte mit dieser Reaktion zusammenhängen könnten. Im Falle der PHMB-vermittelten Wirkungen schien eine SOS-Reaktion jedoch unwahrscheinlich. Erstens wird die SOS-Reaktion in der Regel mit DNA-Schäden in Verbindung gebracht, und es gibt keine Hinweise auf PHMB-vermittelte genotoxische oder epigenetische Wirkungen23. Zweitens trat die nach ftsZ-Silencing und PHMB-Behandlung beobachtete Kondensation in einem recA-Stamm (TOP10) auf, der eine SOS-Reaktionsmutante ist. Dennoch sind antimikrobielle Mechanismen bekanntermaßen schwer zu entschlüsseln und können mehrere Mechanismen beinhalten. Daher beschlossen wir, die mögliche Beteiligung einer SOS-Reaktion und anderer Stressreaktionswege mit Hilfe eines SOS-Reporterstamms und einer Reihe von E. coli-Stressreaktionsweg-Mutanten zu untersuchen.
Um zu testen, ob PHMB-vermittelte Effekte auf die Zelldehnung und Chromosomenkondensation durch Mutationen des SOS-Reaktionswegs verändert werden, haben wir die morphologischen Reaktionen in drei mutierten E. coli-Stämmen untersucht. Der Stamm SS996 ist in der Lage, eine SOS-Reaktion auszulösen, aber aufgrund einer SulB-Mutation führt die Reaktion nicht zu einer Hemmung der Zellteilung. Dies liegt daran, dass SS996 ein mutiertes Allel von ftsZ (sulB103) besitzt, dessen Produkt unempfindlich gegenüber der Wirkung des SOS-induzierten Zellteilungsinhibitors SulA24 ist. Der Stamm JW2669 produziert kein funktionelles RecA und ist daher SOS-defizient. Der Stamm AB2474 weist eine Mutation im LexA-Repressor auf, die dazu führt, dass dieser nicht durch RecA gespalten werden kann und somit keine SOS-Reaktion auslöst (weitere Einzelheiten zum Stamm sind in Abb. 3 und in der ergänzenden Informationstabelle 3 zu finden). Kulturen in der mittleren logarithmischen Phase wurden mit PHMB behandelt, mit DAPI gefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Wie bei E. coli K-12 beobachtet, zeigten die mutierten Stämme nach der PHMB-Behandlung eine verlängerte Morphologie und kondensierte Chromosomen (Abb. 3a). Daher treten PHMB-vermittelte Zellteilungs- und Chromosomenstruktureffekte unabhängig von einer programmierten SOS-Antwort auf.
Auswirkungen von PHMB auf bakterielle SOS-Reaktionen.
(a) Chromosomenkondensation in den E. coli-Stämmen SS996 (sulB103; FtsZ-Mutante, die unempfindlich gegenüber SulA ist), JW2669 (recA-; Knock-out von recA) und AB2474 (lexA1, Mutation, die die Induktion der SOS-Antwort verhindert) nach 2-stündiger Behandlung mit PHMB. Die Zellen wurden mit DAPI gefärbt, um die DNA sichtbar zu machen. (b) Expression des SOS-Reporters, quantifiziert durch Fluorimetrie. Der SOS-Reporter-E. coli-Stamm SS996, der eine chromosomale sulAp-gfp-Fusion trägt, wurde unbehandelt oder mit PHMB, Mitomycin C, einem bekannten SOS-Induktor, oder Triclosan, das keine SOS-Reaktion auslöst, behandelt. Die MHK-Werte gegen SS996 waren PHMB, 0,75 μg/mL; Triclosan, 2 μg/mL; Mitomycin C, 0,06 μg/mL und diese Werte wurden zur Berechnung der %MIC verwendet.
Um direkter zu messen, ob PHMB eine SOS-Reaktion auslöst, verwendeten wir den E. coli-Stamm SS996, einen Reporterstamm, der ein chromosomales sulAp-gfp-SOS-Reaktions-/Reportersystem enthält24,25. Wenn eine SOS-Reaktion durch PHMB ausgelöst wird, dann sollte die PHMB-Exposition die GFP-Expression in diesem Stamm induzieren. SS996-Kulturen wurden 18 Stunden lang mit PHMB behandelt und anschließend wurde die grüne Fluoreszenz gemessen. Mitomycin C, das die DNA schädigt, wurde als Positivkontrolle und Triclosan, das die Fettsäurebiosynthese hemmt, als Negativkontrolle eingesetzt. Wie erwartet, führte Mitomycin C zu einem starken Anstieg der GFP-Expression, während Triclosan die GFP-Expression nicht induzierte. Im Gegensatz zu Mitomycin C induzierte PHMB keine GFP-Expression, was darauf hindeutet, dass PHMB keine SOS-Antwort auslöst (Abb. 3b).
Als Nächstes testeten wir, ob sich Stämme mit defekten oder deregulierten SOS-Antworten in ihrer Anfälligkeit für PHMB unterscheiden. Um die recA-vermittelten Auswirkungen auf die Anfälligkeit zu testen, verwendeten wir einen E. coli-Stamm, dem recA fehlt (JW2669), und einen Stamm, der recA bei Zugabe des Induktors IPTG überexprimiert (ASKA JW2669), und bestimmten die MHK-Werte. Weder die Deletion noch die induzierte Überexpression von recA veränderten die Anfälligkeit für PHMB (Zusatzinformation Tabelle 3, dunkelgrau schattierte Zeilen). Im Gegensatz dazu war der recA-Stamm 2-fach empfindlicher gegenüber dem SOS-Reaktionsauslöser Nalidixinsäure, und die recA-Überexpression verringerte die Anfälligkeit gegenüber Nalidixinsäure um das 8-fache. Um die durch lexA vermittelten Auswirkungen auf die PHMB-Empfindlichkeit zu testen, verwendeten wir den lexA1(Ind-)Stamm AB2474, der keine SOS-Reaktion auslösen kann. Im Vergleich zum Elternstamm war AB2474 um ein Vielfaches empfindlicher gegenüber PHMB und um ein Vielfaches weniger empfindlich gegenüber Nalidixinsäure (ergänzende Tabelle 3, hellgrau schattierte Zeilen). Daher zeigte keine der getesteten SOS-Antwort-Mutanten Veränderungen in der Anfälligkeit für PHMB, die auf die Beteiligung einer SOS-Antwort hindeuten.
Schließlich untersuchten wir, ob andere (nicht-SOS) Stressreaktionswege die Anfälligkeit für PHMB beeinflussen. Wir testeten eine Reihe von bekannten E. coli-Stressreaktionsmutanten parallel zu ihren Eltern auf ihre Anfälligkeit für PHMB. Keine der Mutanten wies Veränderungen der MHK-Werte auf, die auf eine funktionelle Beteiligung eines der Stressreaktionswege schließen lassen (ergänzende Tabelle 3). Daher treten die antibakteriellen Wirkungen von PHMB unabhängig von der Gruppe der getesteten Stressreaktionsmechanismen auf.
PHMB kondensiert bakterielle Chromosomen in vitro
Wenn PHMB bakterielle Chromosomen innerhalb von Zellen kondensiert, könnte dies durch direkte oder indirekte Effekte auf die DNA geschehen. Wir vermuteten direkte Wirkungen, da PHMB in vitro nachweislich an DNA-Fragmente bindet15. Wir beschlossen, die DNA-Bindungseigenschaften von PHMB mit isolierter chromosomaler E. coli-DNA zu untersuchen. Die PHMB-DNA-Wechselwirkungen wurden zunächst mit Hilfe eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) und eines Farbstoffausschluss-Tests untersucht. PHMB wurde mit aus E. coli K-12 isolierter chromosomaler DNA gemischt, und die Mischungen wurden in Agarose/TBE-Gelen fraktioniert, gefolgt von einer DNA-Färbung mit Ethidiumbromid. PHMB:DNA-Mischungen mit Gewichtsverhältnissen von ≥0.5 zeigte eine deutlich verzögerte elektrophoretische Mobilität, was durch den Verbleib der DNA in der Vertiefung angezeigt wurde (Abb. 4a). Ähnliche Ergebnisse wurden für PHMB-FITC erzielt. Die verzögerte Mobilität und der Verbleib in den Vertiefungen stehen im Einklang mit stabilen Wechselwirkungen zwischen PHMB und DNA. Außerdem zeigten die EMSA-Tests eine verringerte Ethidiumbromid-Fluoreszenz in Gegenwart von PHMB oder PHMB-FITC, was darauf hindeutet, dass Ethidiumbromid durch die Bildung von PHMB:DNA-Komplexen an der Bindung an die DNA gehindert wurde. Diese Beobachtung wurde unter Verwendung des DNA-Bindungsfarbstoffs SYTOX®Green in einem Farbstoffausschlusstest weiter untersucht. In Abwesenheit von PHMB band SYTOX®Green isolierte E. coli-DNA, was durch einen starken Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zur Zugabe des Farbstoffs allein angezeigt wurde. Die vorherige Zugabe von PHMB verringerte jedoch die Fluoreszenz um >80% (Abb. 4b). PHMB bildet also mit der bakteriellen DNA Komplexe, die die elektrophoretische Mobilität verlangsamen und den Zugang der DNA zu den DNA-Liganden verschleiern. Die Ergebnisse all dieser Experimente deuten darauf hin, dass PHMB direkt an die DNA bindet.
PHMB bindet in vitro an bakterielle chromosomale DNA.
(a) PHMB oder PHMB-FITC wurde mit isolierter chromosomaler DNA aus E. coli Stamm K-12 gemischt und die Proben wurden mittels EMSA analysiert. Die Muster der verzögerten Mobilität im Gel weisen auf eine DNA-Bindung durch PHMB hin. (b) PHMB-vermittelter Ausschluss der Bindung von SYTOX®Green an isolierte chromosomale E. coli-DNA, wobei die reduzierte Fluoreszenz auf eine DNA-Bindung durch PHMB hinweist. (c) Zirkulardichroismus-Spektroskopie von Mischungen aus PHMB und isolierter chromosomaler E. coli-DNA. (d) Diagramm der Elliptizität als Funktion des PHMB:DNA-Verhältnisses.
Um mehr darüber zu erfahren, wie sich die Bindung von PHMB an die DNA auf die Struktur der chomosomalen DNA auswirkt, haben wir biophysikalische Methoden und Mikroskopie eingesetzt. Kombinationen von PHMB und isolierter chromosomaler E. coli-DNA wurden mittels Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie untersucht. PHMB allein zeigte kein charakteristisches CD-Spektrum, wohingegen isolierte chromosomale DNA ein typisches DNA-Spektrum mit einem positiven Elliptizitätsmaximum bei 260 nm, einem negativen Cross-Over bei 252 nm und einem negativen Tiefpunkt bei etwa 245 nm zeigte. Dies ermöglichte es uns, die Veränderungen im CD-Spektrum der DNA nach Zugabe von PHMB zu beurteilen. Mischungen aus PHMB und DNA zeigten eine verringerte Elliptizität bei 260 nm, was auf strukturelle Veränderungen der DNA nach der PHMB-Bindung hindeutet (Abb. 4c,d). Auch die dynamische Lichtstreuung (DLS) zeigte, dass die Bindung von PHMB an die DNA zur Bildung von Nanopartikeln mit einer Größe von etwa 50-60 nm und einem niedrigen Polydispersitätsindex führt (ergänzende Abb. 4a). Schließlich zeigten auch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Fluoreszenzmikroskopie, dass die Bindung von PHMB an die DNA zur Bildung von Nanopartikeln führt (ergänzende Abb. 4b,c). Diese Ergebnisse bestätigen daher frühere Berichte, dass PHMB DNA bindet26 und zeigen, dass PHMB isolierte bakterielle chromosomale DNA bindet und Chromosomen zu einer Population von Nanopartikeln mit geringer Polydispersität kondensieren kann.
Die antibakteriellen Wirkungen von PHMB werden durch einen dsDNA-Liganden unterdrückt
Unsere Ergebnisse für die Wirkungen von PHMB auf Bakterien lassen sich nicht mit dem Modell der Membranzerstörung für den primären antibakteriellen Wirkmechanismus von PHMB in Einklang bringen. Vielmehr schlagen wir ein neues Modell vor, bei dem PHMB in Bakterien eindringt und dann Chromosomen kondensiert, wie in Abb. 5a dargestellt. Wenn das neue Modell korrekt wäre, würde es auch funktionelle Wechselwirkungen zwischen PHMB und anderen DNA-Liganden vorhersagen, und diese Idee bot uns eine Möglichkeit, das Modell zu testen. Kurz gesagt, wenn dieses Modell korrekt wäre, würde man erwarten, dass DNA-Liganden mit geringem Molekulargewicht die antibakterielle Wirksamkeit von PHMB unterdrücken, indem sie um DNA-Bindungsstellen in Chromosomen konkurrieren. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden paarweise Kombinationen von PHMB und Hoechst 33258 in Wachstumsanfälligkeitstests verwendet. Hoechst 33258 ist ein DNA-Ligand, der bevorzugt an die Nebenfurche von AT-reichen Sequenzen27 bindet und zellpermeabel ist, was ihn für dieses Konkurrenz-Experiment geeignet macht.
Modell für den antibakteriellen Wirkmechanismus von PHMB und Unterdrückung der Wachstumshemmung.
(a) Vorgeschlagener antibakterieller Wirkmechanismus von PHMB. (b) Paarweise wachstumshemmende Wechselwirkungen zwischen PHMB und Hoechst 33258 sowie nicht-DNA-bindenden Liganden der Negativkontrolle (Triclosan und Trimethoprim) bei verschiedenen Bakterienarten. (c) Beziehung zwischen dem AT-Gehalt des bakteriellen Genoms und den antibakteriellen Wechselwirkungen mit PHMB. Darstellung der wachstumshemmenden Wechselwirkungen und des AT-Gehalts der DNA bei verschiedenen Arten. Die Interaktionswerte sind fraktionelle Hemmkonzentrationsindikatoren (FICI) zwischen PHMB und Hoechst 33258 oder nicht-DNA-bindenden Liganden der Negativkontrolle (Trimethoprim und Triclosan). (d) Wachstumshemmung von Bacillus megaterium durch PHMB und Unterdrückung durch Kombinationen mit dem DNA-Liganden Hoechst 33258 (blaue Linien). Siehe ergänzende Tabelle 4 für die Speziesliste und die Hemmungswerte.
Die Wechselwirkungen zwischen den Arzneimitteln wurden als Indexwerte der fraktionierten Hemmungskonzentration (FICI) unter Verwendung eines Panels divergierender Bakterienspezies berechnet. Die FICI-Werte für PHMB:Hoechst waren signifikant höher als für PHMB in Kombination mit einem der beiden antibakteriellen Nicht-DNA-Liganden (Abb. 5b). Die FICI-Werte für PHMB:Hoechst-Kombinationen zeigen außerdem eine positive Korrelation mit dem AT-Gehalt der Chromosomen (Abb. 5c). Mit anderen Worten: Die antimikrobielle Wirkung von PHMB hängt vom Zugang zur DNA innerhalb der Zellen ab. Bei B. megaterium waren die Wirkungen von PHMB:Hoeschst-Kombinationen auffallend, wobei die Wachstumshemmung durch PHMB durch subinhibitorische Hoeschst 33258-Konzentrationen unterdrückt wurde (Abb. 5d). Daher rettete der niedermolekulare DNA-Ligand Hoechst 33258 die Bakterien vor den hemmenden Konzentrationen von PHMB.
Diese paarweisen Arzneimittelinteraktionen zeigen, dass die antibakteriellen Wirkungen von PHMB hauptsächlich über den Angriff auf die DNA in Bakterien erfolgen. In Übereinstimmung mit dem für PHMB beobachteten Veränderungsprofil der Zellpermeabilität (Abb. 1b) deuten die Ergebnisse auch auf eine Konkurrenz zwischen PHMB und einem DNA-Liganden um DNA-Bindungsstellen in Zellen hin. Daher stimmen die Ergebnisse aus separaten Experimenten mit zwei bekannten DNA-Liganden mit unserem neuen Modell für die Aktivität von PHMB überein.
PHMB dringt in Säugetierzellen ein, wird aber von Kernen ausgeschlossen
Das vorherrschende Modell für die Aktivität von PHMB besagt, dass PHMB Bakterien durch Schädigung der Bakterienmembran abtötet und das Polymer nicht mit Säugetierzellmembranen interagiert (siehe oben). Angesichts der unerwarteten Eigenschaften von PHMB, in bakterielle Zellen einzudringen, und unserer jüngsten Beobachtungen, dass PHMB in kultivierte Makrophagen28 und Keratinozyten29 eindringt, beschlossen wir, seine Fähigkeit, in eine Reihe von Säugetierzellen einzudringen, direkt zu untersuchen. PHMB-FITC wurde mehreren Säugetierzelllinien und primären Fibroblasten zugesetzt, und die Aufnahme wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht. Wir beobachteten eine deutliche Aufnahme in alle getesteten Zelltypen (Abb. 6a,b). Außerdem führten diese Bedingungen nicht zu einer Störung der Integrität der Säugetierzellmembran (ergänzende Abb. 5a). Bei genauer Betrachtung der mikroskopischen Bilder zeigt sich, dass PHMB-FITC in Vesikeln enthalten und von Kernen ausgeschlossen war (Abb. 6a). Wenn es stimmt, dass Endosomen PHMB einschließen, dann sollte die Freisetzung in das Zytoplasma PHMB-FITC abschwächen und zu einem Anstieg der Fluoreszenz führen. Dies liegt daran, dass die FITC-Fluoreszenz bei niedrigem pH-Wert gelöscht wird und der späte endosomale pH-Wert <630 ist, während der zytoplasmatische pH-Wert 7,4 beträgt. Wir beobachteten, dass die Zugabe von Chloroquin, einem Osmolytikum/Puffermittel31, die Fluoreszenz von mit PHMB-FITC behandelten Zellen erhöhte (Abb. 6c), was mit dem Einschluss des Polymers in den Endosomen übereinstimmt. PHMB dringt also effizient in Säugetierzellen ein, wird aber in Endosomen eingeschlossen, was den Eintritt in Kerne zu beschränken scheint.
PHMB Eintritt in Säugetierzellen.
(a) Primäre Fibroblasten wurden mit PHMB-FITC (3,5 μg/mL) behandelt, mit Hoechst 33258 gegengefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. (b) Durchflusszytometrische Analyse einer Gruppe von Säugetierzellen, die mit PHMB-FITC behandelt wurden. Inset: ein repräsentatives Beispiel eines Durchflusszytometrie-Histogramms von HeLa-Zellpopulationen, die unbehandelt (lila Population) oder mit PHMB-FITC (0,4 μg/mL) behandelt wurden (grüne Population). (c) HeLa-Zellen wurden 2 Stunden lang mit PHMB-FITC (3,5 μg/mL) und Chloroquin (0-20 μM) behandelt. Die Auswirkungen von Chloroquin auf die Fluoreszenz wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität (arbiträre Einheiten (A.U.), logarithmische Skala) gemessen.