RECEPTOR
Der Erythropoetin-Rezeptor wurde durch eine Expressionsstrategie aus einer cDNA-Bibliothek von erythroleukämischen Zellen der Maus kloniert (D’Andrea et al., 1989). Das menschliche Erythropoetin-Rezeptor-Gen ist auf Chromosom 19p lokalisiert (Winkelman et al., 1990). Es besteht aus acht Exons und sieben Introns und kodiert ein Peptid mit 507 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 66 kDa. Im menschlichen Gen kodieren die Exons 1-5 für die extrazelluläre Domäne mit 251 Aminosäuren, Exon 6 für eine membranüberspannende a-helicale Region mit 20 Aminosäuren und die Exons 7-8 für die zytoplasmatische Domäne mit 236 Aminosäuren (Youssoufian et al., 1993). Der menschliche Erythropoietin-Rezeptor hat keine N-gebundenen Glykosylierungsstellen, aber eine hohe Frequenz von Serin- und Threoninresten (Jones et al., 1990). Es besteht eine 82%ige Identität zwischen dem menschlichen und dem murinen Erythropoietin. Bei der Quervernetzung von Erythropoietin auf der Zelloberfläche erythroider Zellen wurden zwei akzessorische Moleküle von 85 und 100 kDa entdeckt, die von Anti-p66-Antikörpern nicht erkannt werden (D’Andrea und Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Ihre Funktion muss jedoch noch bestimmt werden.
Der Erythropoietinrezeptor gehört zur Typ-1-Familie der Einzeltransmembran-Zytokinrezeptoren. Diese Familie teilt eine konservierte extrazelluläre Domäne, die aus Fibronektin-Typ-III-Subdomänen (FNIII) besteht, sowie ein konserviertes zytoplasmatisches Box-1-Motiv der α-Kette, das selektiv an Janus-Kinasen (JAK) bindet (Bazan, 1990b). Der extrazelluläre Bereich des Erythropoietin-Rezeptors enthält zwei FNIII-Subdomänen (D1 und D2), die eine L-Form bilden, wobei die Längsachse jeder Domäne in einem Winkel von etwa 90° zur anderen Achse ausgerichtet ist. Die NH2-terminale D1-Domäne besteht aus vier auf vier a-Strängen und die D2-Domäne aus sieben aniparallelen a-Strängen (Livnah et al., 1996). Die D1-Domäne bildet eine h-Typ-Faltung mit einer hybriden FNIII/Immunglobin-ähnlichen Topologie, und zwei distale Paare von Cysteinresten bilden Disulfidbrücken. Die membrannahe D2-Domäne faltet sich mit einer Standard-FNIII-Topologie vom s-Typ und enthält ein konserviertes WSXWS-Motiv (d. h. Tryptophan-Serin-eine beliebige Aminosäure-Tryptophan-Serin), das für die Faltung des Erythropoetin-Rezeptors wichtig ist (Quelle et al., 1992). Die D1- und D2-Domänen tragen zusammen mit sechs Schleifen zu den Erythropoetin-Interaktionen bei. Die zytoplasmatische Region, die reich an den Aminosäuren Prolin, Glutamin und Aspartase ist, enthält eine Box-1-Domäne (Reste 257-264), die spezifisch für JAK2 ist (Zhuang et al., 1994; Jiang et al., 1996), eine Box-2-Domäne (Reste 303-313) und acht Phosphotyrosinstellen (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479), die die Rekrutierung von Effektoren vermitteln, die für die Src-Homologie-2-Domäne (SH2) codieren. Eine verlängerte Box2 (Reste 329-372) ist für die Bindung des Tyrosinkinase-Rezeptors KIT nach Aktivierung durch seinen Liganden wesentlich und bewirkt eine Tyrosinphosphorylierung des Erythropoetin-Rezeptors, was auf eine funktionelle Interaktion zwischen beiden Rezeptoren hindeutet (Wu et al., 1995a). Erythropoietin aktiviert den Erythropoietin-Rezeptor durch Dimerisierung (Philo et al., 1996). Ein p66-Molekül bindet Erythropoietin mit hoher Affinität (Kd um 1 nM), das andere mit geringerer Affinität (Kd um 2 μM). Durch Mutationen und Deletionen wurden die aktiven Stellen von Erythropoietin kartiert (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Bivalente, aber nicht monovalente monoklonale Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des Erythropoietin-Rezeptors gerichtet sind, induzieren die Proliferation von Erythropoietin-abhängigen Zelllinien und die Bildung von BFU-E, was auf eine Aktivierung des Rezeptors durch seine Dimerisierung schließen lässt (Elliot et al., 1996). Die gleiche Wirkung kann mit kleinen erythropoietin-mimetischen Peptiden (EMP) erzielt werden (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Obwohl EMP keine Sequenzhomologie mit Erythropoietin aufweisen, binden sie spezifisch an den Erythropoietin-Rezeptor. Punktmutationen in der extrazellulären Domäne (R129C, E132C oder E133C) bilden Disulfidbindungen und aktivieren konstitutiv auch den Rezeptor (Watowich et al., 1994). Insbesondere die Mutation des Arginin 129-Restes zu einem Cystein ist onkogen und induziert Erythroleukämie (Longmore und Lodish, 1991). Im Gegensatz dazu ist EMP33 in der Lage, den Rezeptor zu dimerisieren, aber nicht zu aktivieren, was darauf hindeutet, dass die Konformationsänderung im dimerisierten Rezeptor eine wesentliche Rolle für seine Signalwirkung spielt (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). Es wurde vorgeschlagen, dass es auf der Zelloberfläche präformierte inaktive Rezeptordimere gibt, die durch die dazwischen liegenden D1-D2-Regionen vermittelt werden und eine Trennung von 79 A an der Basis ihrer extrazellulären Domänen bewirken (Livnah et al., 1996). Nach der Bindung eines Agonisten ändern die extrazellulären Rezeptordomänen ihre Struktur in einer definierten Ausrichtung mit einem Abstand von 39 Å, was zu einer Anpassung ihrer zytoplasmatischen Komponenten und zur Signalübertragung führt (Wilson und Jolliffe, 1999).
Neben der Bindung von Erythropoietin kann der Erythropoietin-Rezeptor durch andere Mechanismen aktiviert werden. Das gp55-Hüllprotein, das vom murinen Friend-Virus kodiert wird, löst bei Mäusen Erythroleukämie aus, nachdem es an den murinen Erythropoietin-Rezeptor gebunden und diesen aktiviert hat (Wolff und Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Darüber hinaus sind synthetische Peptide, die keine Sequenzhomologie mit Erythropoietin aufweisen, in der Lage, den Erythropoietin-Rezeptor zu stimulieren (siehe unten).