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Korrekturfaktoren und Erkennungssignale

Ein Modellsystem für die Enzymersatztherapie entstand aus Untersuchungen an kultivierten Hautfibroblasten von Patienten mit Mukopolysaccharid-Speichererkrankungen (MPS). Diese Fibroblasten zeigten eine übermäßige Anhäufung von Glykosaminoglykanen, was als Folge eines unzureichenden Abbaus dieser Makromoleküle gedeutet wurde. Durch einen glücklichen Zufall wurde entdeckt, dass eine Mischung von Fibroblasten, die von Patienten mit MPS I (Hurler-Syndrom) und MPS II (Hunter-Syndrom) stammten, ein normales Muster des Glykosaminoglykan-Stoffwechsels aufwiesen (Abbildung 1). Es war bekannt, dass sich die beiden Krankheiten genetisch unterscheiden, wobei MPS I autosomal rezessiv und MPS II X-chromosomal vererbt wird, was Fratantoni et al. zu der Hypothese veranlasste, dass die Fibroblasten verschiedener Genotypen sich gegenseitig mit dem fehlenden Genprodukt versorgen. Weitere Studien zeigten, dass es für eine solche Kreuzkorrektur nicht notwendig ist, die genetisch unterschiedlichen Zellen miteinander in Kontakt zu bringen, da das von einer Zelle konditionierte Medium für die andere korrigierend wirken kann. Die Strategie der Kreuzkorrektur könnte auf verwandte Krankheiten ausgedehnt werden – Zellen, die sich gegenseitig korrigierten, hätten einen anderen Genotyp, während Zellen, die sich nicht gegenseitig korrigierten, denselben Genotyp hätten (siehe jedoch die wichtige Ausnahme weiter unten).

Da das Hurler-Syndrom aufgrund der Beobachtung der dramatisch angeschwollenen Leberlysosomen bei betroffenen Patienten als lysosomale Speicherkrankheit postuliert worden war, stellten Fratantoni et al. die Hypothese auf, dass es sich bei den „Korrekturfaktoren“ im konditionierten Medium um lysosomale Enzyme handeln könnte, die von einer Zelllinie sezerniert und von der anderen endozytiert werden. Die Korrekturfaktoren entsprachen jedoch keinem damals bekannten lysosomalen Enzym (diese Situation änderte sich einige Jahre später, als ein β-Glucuronidase-Mangel-MPS entdeckt wurde). Die Hurler- und Hunter-Korrekturfaktoren wurden gereinigt, und zwar nicht aus konditioniertem Medium, sondern aus Urin, einer Körperflüssigkeit, die relativ reich an lysosomalen Enzymen ist. Den gereinigten Faktoren wurde mit Hilfe verschiedener biochemischer Methoden eine Funktion zugeordnet, was dazu führte, dass die Hurler- und Hunter-Korrekturfaktoren als α-l-Iduronidase bzw. Iduronat-Sulfatase bezeichnet wurden.

Zellen, die den Hurler-Korrekturfaktor zur Normalisierung ihres Glykosaminoglykan-Stoffwechsels benötigten (von Patienten mit Hurler-Syndrom und mit Scheie-Syndrom), wiesen ebenfalls einen Mangel an α-l-Iduronidase-Aktivität auf). Die Korrektur der Hurler-Fibroblasten ging mit der Aufnahme von α-l-Iduronidase einher. Wie es sich für eine Enzymersatztherapie gehört, war die Aufnahme bemerkenswert effizient, und es musste nur eine sehr geringe Menge α-l-Iduronidase internalisiert werden, um eine vollständige Korrektur zu erreichen.

Damit könnte die Geschichte zu Ende sein, wäre da nicht eine kleine Diskrepanz im Elutionsmuster der enzymatischen Aktivität und der Korrekturaktivität aus einer Hydroxyapatitsäule gewesen, die darauf hindeutet, dass die beiden Aktivitäten des Hurler-Korrekturfaktors nicht genau identisch waren. Im Anschluss an diese Diskrepanz trennten Shapiro et al. die α-l-Iduronidase auf einer Heparin-Sepharose-Säule in korrigierende und nicht-korrektive Fraktionen auf, was darauf hindeutet, dass der Korrekturfaktor eine Eigenschaft aufweist, die nicht für die katalytische Aktivität, sondern für die Aufnahme benötigt wird. In ähnlicher Weise wurden mehrere Formen von β-Glucuronidase gefunden, die sich in Aufnahme und korrigierender Aktivität unterschieden.

Die Existenz eines spezifischen Signals für die Aufnahme eines lysosomalen Enzyms war durch die Ergebnisse einer Studie über eine neu entdeckte, MPS-ähnliche Störung nahegelegt worden, die aufgrund der auffälligen phasendichten Einschlüsse in kultivierten Fibroblasten als Einschlusszellkrankheit (I-Zell-Krankheit) bezeichnet wurde. Während diese Fibroblasten einen mehrfachen Mangel an lysosomalen Enzymen aufwiesen, enthielt das sie umgebende Medium einen großen Überschuss an lysosomalen Enzymen. Die von den Fibroblasten der I-Zell-Krankheit ausgeschiedenen Enzyme wurden jedoch nicht von anderen Zellen endozytiert und waren nicht korrigierend; vermutlich fehlte ihnen das Signal für die Aufnahme in die Lysosomen. Da eine Reihe von lysosomalen Enzymen von diesem einzigen Gendefekt betroffen waren (die I-Zell-Krankheit wird autosomal rezessiv vererbt), wurde das Signal als posttranslationale Modifikation der Enzymproteine postuliert. Außerdem wurde angenommen, dass es sich um ein Kohlenhydrat handelt, da es durch eine milde Periodat-Behandlung zerstört werden kann. Das Konzept eines auf Kohlenhydraten basierenden Erkennungssystems wurde stark von den Entdeckungen von Ashwell und Kollegen über die Rolle von Kohlenhydraten bei der Aufnahme zirkulierender Glykoproteine durch die Leber beeinflusst.

Das Vorhandensein eines spezifischen erkennbaren Signals implizierte einen sättigbaren, rezeptorvermittelten Prozess und legte nahe, dass die Aufnahme lysosomaler Enzyme einer Michaelis-Menten-Kinetik folgen würde. Es wurde erwartet, dass sich Analoga der Erkennungssignale als kompetitive Inhibitoren der Aufnahme verhalten würden. Diese Erwartung wurde anhand der Aufnahme von α-l-Iduronidase und von β-Glucuronidase durch die entsprechenden defizienten Fibroblasten untersucht. Die Entdeckung von Kaplan et al., dass der beste Inhibitor für die Aufnahme von β-Glucuronidase Mannose-6-Phosphat (M6P) ist, und ihre Vermutung, dass M6P das lange gesuchte Erkennungssignal ist (oder ein Teil davon), war verblüffend, da zuvor kein phosphoryliertes Kohlenhydrat auf Glykoproteinen von Säugetieren gefunden worden war. Es wurde sofort für die Aufnahme von α-l-Iduronidase und anderen lysosomalen Enzymen bestätigt, wobei eine Vielzahl biochemischer Methoden angewandt wurde; der endgültige Beweis kam durch die Strukturanalyse der phosphorylierten Kohlenhydratgruppen. Das durch Endozytose entdeckte Signal erwies sich auch als das Signal für die Ausrichtung von naszierenden Hydrolasen auf Lysosomen.

Der Defekt bei der I-Zell-Krankheit, der die Zellen daran hindert, das M6P-Erkennungssignal zu synthetisieren, erwies sich als ein Mangel des ersten von zwei Enzymen, die an der Synthese des M6P-Signals beteiligt sind. Zwei Rezeptoren für M6P wurden entdeckt; die Chemie und Biologie der M6P-Rezeptoren und ihre Rolle beim Zellverkehr wurden zu einem breiten und sehr aktiven Gebiet der Zellbiologie. Diese Themen sind Gegenstand zahlreicher Übersichtsarbeiten, einschließlich der Kapitel 3 und 5 dieses Bandes. Die Bedeutung des M6P-Systems für die Enzymersatztherapie wird weiter unten erörtert.

Gleichzeitig mit diesen Studien an kultivierten Fibroblasten führte ein In-vivo-System zur Entdeckung eines weiteren Signals für die Aufnahme lysosomaler Enzyme. Es wurde festgestellt, dass mehrere lysosomale Enzyme, die Ratten intravenös injiziert wurden, rasch aus dem Blutkreislauf ausgeschieden wurden; sie blieben jedoch wesentlich länger erhalten, wenn sie mit Periodat vorbehandelt oder zusammen mit einem Agalaktoglykoprotein injiziert wurden. Auch hier wurden Kohlenhydrate als Signalgeber für die spezifische Erkennung postuliert. In diesem Fall war der Schlüsselzucker für die Erkennung Mannose, und die Aufnahme erfolgte in retikuloendotheliale Zellen der Leber. Der Mannose-Rezeptor, der neben Mannose auch N-Acetylglucosamin und L-Fucose erkennt, wurde auf der Oberfläche von Makrophagen nachgewiesen. Es ist von einigem historischen Interesse, dass die Experimente zur Aufnahme von Invertase, die im ursprünglichen Vorschlag für eine Enzymersatztherapie (siehe oben) eine wichtige Rolle spielten, erfolgreich waren, weil Invertase ein Glykoprotein mit Mannanketten ist, die vom Mannoserezeptor erkannt werden.