Biochemische und pathogene Eigenschaften von Shewanella alga und Shewanella putrefaciens

ERGEBNISSE

Die Biotypisierung von Shewanella-Isolaten nach zwei verschiedenen Schemata lieferte ähnliche Ergebnisse (Tabelle 1). Die meisten klinischen Isolate (74 %) gehörten zum Gilardi-Biovar 2 (CDC-Biotyp 2) und waren Saccharose- und Maltose-negativ, während sie auf SS-Agar und auf Medien mit hohen NaCl-Konzentrationen wuchsen. Der einzige große Unterschied zwischen dem Gilardi-Klassifizierungsschema (6) und dem von Weyant et al. (22) bestand darin, dass die Isolate von Biovar 3 (Saccharose-, Maltose-, SS- und NaCl-negativ) im CDC-Biotypisierungssystem nicht gruppiert wurden. Im Gegensatz zu den menschlichen Isolaten überwiegt bei den nicht-menschlichen Stämmen Biovar 1 (CDC-Biotyp 1) (67 %). Diese Stämme produzierten in der Regel Säure aus Maltose und/oder Saccharose und wuchsen nicht auf stark salzhaltigem oder SS-Agar. Auf der Grundlage der jüngsten taxonomischen Vorschläge von Nozue und anderen (15) würden die Stämme der Biovarie 2 (CDC-Biotyp 2) als S. alga identifiziert, während alle Stämme der Biovarie 1 (CDC-Biotyp 1) und 6 von 7 Stämmen der Biovarie 3 als S. putrefaciens bezeichnet würden; der verbleibende Stamm der Biovarie 3 wurde anschließend als S. alga identifiziert. Klinisch wurde festgestellt, dass S. alga überwiegt (77 %), während die Mehrheit der nicht-humanen Isolate (89 %) als S. putrefaciens bestätigt wurde (Tabelle 1).

Alle 10 Shewanella-Isolate wurden bei Tests mit den Systemen API 20E, API NFT, RapID NF Plus und Vitek alsS. putrefaciens identifiziert, mit einer Ausnahme. Vier der fünf S. putrefaciens-Isolate ergaben unannehmbare Profilnummern auf dem API 20E-System (Nr. 0602026 und 0602006); der fünfte Stamm ergab eine seltene Biotypnummer für S. putrefaciens. Alle S. alga-Stämme ließen sich mit dem API 20E hervorragend als S. putrefaciens identifizieren. Das API NFT-System identifizierte alle 10 Shewanella-Isolate als S. putrefaciens mit guten bis ausgezeichneten Identifizierungen, mit einer Ausnahme, ebenfalls ein S. putrefaciens-Stamm (niedriger Unterscheidungswert, 48 h). RapID NF Plus identifizierte alle 10 Shewanella-Isolate mit einer Genauigkeit von 99,9 % als S. putrefaciens. In ähnlicher Weise wurden alle Stämme von Vitek (97 bis 99 % Genauigkeit) als S. putrefaciens identifiziert, obwohl drei S. putrefaciens-Stämme 5 bis 9 Stunden Inkubation benötigten, bevor sie endgültig identifiziert werden konnten, im Gegensatz zu den 4-Stunden-Ergebnissen für die anderen 7 Stämme. Die Kohlenhydratreaktionen (Arabinose und Maltose) auf den Systemen API 20E, API NFT und Vitek ermöglichen es jedoch, die meisten Stämme korrekt den entsprechenden Taxa (S. putrefaciens und S. alga) zuzuordnen, wenn sie nach der endgültigen Identifizierung als S. putrefaciens manuell abgelesen werden.

Der Vergleich der biochemischen und enzymatischen Eigenschaften vonShewanella-Arten ergab eine Reihe von Unterschieden (Tabelle 2). Die von Nozue et al. (15) beschriebene Hämolyse auf Schafsblutagar wurde bei allen S. alga-Stämmen, aber nur bei einigen S. putrefaciens-Isolaten festgestellt. Die meisten S. alga-Stämme wiesen diesen Phänotyp erst nach längerer Inkubation (48 bis 72 Stunden) auf, und der Bereich der Hämolyse war oft unregelmäßig und schwer zu erkennen. Andere Aktivitäten, die zuvor als hilfreich für die Trennung von S. alga und S. putrefaciens angesehen wurden, wie das Wachstum bei 42 °C, das Wachstum auf Medien mit hohen Salzkonzentrationen (6,5 %) und die Säureproduktion aus L-Arabinose, Saccharose und Maltose, wurden bestätigt. Wir fanden eine wesentlich größere Anzahl von S. putrefaciens-Stämmen, die auf SS-Agar wuchsen als bisher berichtet; die meisten davon stammten aus nicht-humanen Quellen. Mit Ausnahme von Ribose war die Produktion von Säure aus der Oxidation von Kohlenhydraten nur bei S. putrefaciens zu beobachten. Die Zuckermuster variierten jedoch beträchtlich zwischen diesen Isolaten, wobei einige Arabinose-, Maltose- und Saccharose-positiv waren, während andere nur für Maltose positiv waren oder asaccharolytisch (Biovar 3-Stämme). Bei ausgewählten Shewanella-Isolaten wurden mehrere neue enzymatische Aktivitäten festgestellt, über die unseres Wissens bisher noch nicht berichtet worden war. Dazu gehörten Tyrosinase-, Alkylsulfatase-, Chitinase- und Elastase-Aktivitäten (Tabelle 2); die meisten dieser Enzyme wurden in nicht humanen Isolaten von S. putrefaciens gefunden. Die meisten S. alga- und S. putrefaciens-Stämme produzierten ein Siderophor, wie mit Chrome-Azurol-S-Tests bestimmt wurde. Diese Aktivität war schwach, und fünf Isolate (drei S. alga- und zwei S. putrefaciens-Isolate) wuchsen nicht auf diesem Medium.

Ausgewählte Shewanella-Isolate, die bei 35°C gut wuchsen, wurden mit Hilfe von API-ZYM (Tabelle 3) auf ihre enzymatische Aktivität und mit dem MIDI-System auf ihre zellulären Fettsäureprofile untersucht. Von den neun Substraten, die von einer oder beiden Shewanella-Arten mit API-ZYM angegriffen wurden, waren die Gesamtaktivitäten für sieben dieser Enzyme bei der S. alga höher. Die einzige Aktivität, die bei S. putrefaciens stärker war, war die Valin-Arylamidase, obwohl diese Aktivität selbst bei diesen Stämmen extrem schwach war. Beide Arten produzierten eine einheitlich starke alkalische Phosphataseaktivität. Eine weitere Beobachtung war, dass alle S. alga-Stämme durchweg acht dieser neun Enzyme produzierten, die einzige Ausnahme war Valin-Arylamidase. Im Gegensatz dazu war S. putrefaciens heterogener, da vier der neun nachgewiesenen Enzyme nicht durchgängig bei allen Isolaten vorhanden waren. Die Analyse von 14 Shewanella-Stämmen ergab, dass die vorherrschenden Fettsäuren i-15:0, 17:1ω8c und 16:0 waren; einige Stämme produzierten große Mengen an 16:1ω7c (9 bis 18 %), während andere vernachlässigbare Mengen produzierten. Während die meisten Fettsäurespitzen bei den getesteten S. alga- und S. putrefaciens-Stämmen recht einheitlich waren, wurden einige Unterschiede festgestellt (Tab.4). Bei S. alga wurden höhere Mittelwerte für Pentadecansäure und cis-9-Heptadecensäure (17:1ω8c) festgestellt, während für S. putrefaciens bei Hexadecansäure und Dodecansäure das Gegenteil der Fall war. Bei der Hexadecansäure gab es keine Überschneidungen im Gesamtfettsäurebereich zwischen S. alga und S. putrefaciens; bei der Pentadecansäure und 17:1ω8c wies nur ein S. putrefaciens- oder S. alga-Isolat einen Wert auf, der in den Bereich des jeweils anderen fiel. Während kein einzelner Peak diagnostisch war, trennte die Verwendung aller vier Peaks zusammen die 14Shewanella-Stämme eindeutig in zwei Gruppen entlang der Spezies-Linien.

Es wurde festgestellt, dass die 23 Stämme von S. putrefaciens anhand verschiedener phänotypischer Merkmale in drei separate Gruppen unterteilt werden konnten (Tabelle 5). Gruppe 1, die aus acht Stämmen, darunter ATCC 8073, bestand, produzierte Säure aus Maltose, Saccharose und Arabinose und verwertete Urocaninsäure. Die Stämme der Gruppe 1 verteilten sich zu gleichen Teilen auf klinische und nicht-humane Isolate. Die Stämme der Gruppe 2 (n = 6), zu denen auch ATCC 8071 gehörte, unterschieden sich von den Stämmen der Gruppe 1 vor allem durch die Unfähigkeit, Saccharose und Maltose zu oxidieren. Auch hier stammte die Hälfte dieser Stämme aus klinischem Material. Die Stämme der Gruppe 3 (n = 9), die alle aus der Umwelt stammten (Gebiet um den Michigansee), unterschieden sich drastisch von den Gruppen 1 und 2. Sie wuchsen schlecht oder gar nicht bei 35 °C, produzierten Chitinase und waren auf Agar mit Tryptophan nicht pigmentiert. Alle neun Stämme der Gruppe 3 produzierten zunächst α-Glucosidase, aber bei einer erneuten Untersuchung waren nur drei Stämme durchweg positiv. Maltose wurde oxidiert, aber nicht Saccharose oder Arabinose. Im Gegensatz zu den Gruppen 1 und 2 wurde Urocaninsäure nicht als Energiequelle genutzt.

In jüngster Zeit haben Vogel und Kollegen (21) Unterschiede zwischen S. alga und S. putrefaciens in ihrer Empfindlichkeit gegenüber bestimmten antimikrobiellen Wirkstoffen, einschließlich Penicillin, Ampicillin und Tetracyclin, festgestellt. In Verbindung mit dem Bericht über die hämolytische Aktivität von S. alga und dem offensichtlichen Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen deutet dies auf mögliche Unterschiede in der Pathogenität dieser beiden Arten hin (Tabelle 6). Wir wählten daher 10 Stämme (5 von jeder Art) für eine weitere Analyse aus. Obwohl wir keine großen Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber Penicillin, Ampicillin und Tetracyclin zwischen diesen beiden Gruppen auf der Grundlage der Empfindlichkeitskategorie (empfindlich, intermediär oder resistent) feststellen konnten, fiel uns auf, dass die mittleren MHKs für S. alga von Penicillin, Ampicillin und Tetracyclin (∼200, 56 und 5.2 μg/ml) größer waren als die entsprechenden MHKs für S. putrefaciens (3, 1,3 bzw. 1,1 μg/ml).

Vier von fünf S. putrefaciens-Stämmen hafteten schwach (+) bis stark (+++) (Tabelle 6) an HEp-2-Zellen in Adhärenztests; im Gegensatz dazu wies kein S. alga-Stamm ähnliche Hafteigenschaften auf, obwohl vier Stämme stark an den Glasobjektträger-Hintergrund banden. Invasive Aktivitäten wurden bei keinemShewanella-Stamm festgestellt. Obwohl bei allen fünf S.-Alga-Stämmen eine verzögerte hämolytische Reaktion auf Schafsblut-Agar beobachtet wurde (Tabelle 2), konnte eine Beta-Hämolyse weder mit der Agar-Overlay-Technik noch mit dem Brühe-Assay nachgewiesen werden (Tabelle 6); E. tarda-Kontrollstämme waren in beiden Tests nach 1 Stunde positiv. Bei allen fünf S. alga-Stämmen (und einem S. putrefaciens-Isolat) wurde während der Adhäsions- und Invasionsstudien manchmal eine schwache zytotoxische Reaktion beobachtet. Diese zytotoxische Reaktion äußerte sich durch das Auftreten von HEp-2-Zellen mit abnormaler Zellmorphologie, einschließlich Zelltrümmern (Ghosts). Es wurden jedoch Unterschiede in der Pathogenität bei Mäusen zwischen diesen beiden Spezies festgestellt, da die mittlere LD50 bei Swiss-Webster-Mäusen für S. algaw 1,9 × 108 KBE betrug, während sie für S. putrefaciens 8,4 × 108 KBE betrug (P < 0,02).