Zelllinien
Die Zelllinien und ihre Quellen sind wie folgt: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932), und HK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1-Zellen wurden freundlicherweise von der Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in DMEM (für 293T und 786-O), MEM (für HK-2) oder RPMI 1640 (THP-1) Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und 2 mM l-Glutamin bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 gezüchtet. Vor der Infektion mit Bakterien, der Behandlung mit Proteinen oder der Chemotaxisanalyse wurde das Medium in ein serumfreies Medium gewechselt.
Bakterienstämme und Plasmide
Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in der ergänzenden Tabelle S3 aufgeführt. Die E. coli-Stämme wurden bei 37 °C in Luria-Bertani (LB)-Medium unter statischen Bedingungen für 12 h kultiviert und bei Bedarf mit geeigneten Antibiotika in folgenden Konzentrationen behandelt: Kanamycin zu 50 μg/ml, Ampicillin zu 100 μg/ml und Chloramphenicol zu 15 μg/ml. Der ΔhlyA-Stamm wurde durch die Substitution von hlyA durch ein cat-Gen unter Verwendung von λ-Red-Rekombinase erzeugt. Zur Erzeugung des ∆hlyA p-hlyA-Stamms wurde das hlyA-Gen durch PCR aus dem Chromosom des UPEC-Stamms CFT073 amplifiziert und an den Enzymstellen KpnI und XbaI in pTRC99A ligiert, und das Plasmid wurde durch Elektroporation in ∆hlyA transformiert. Die hlyC- und hlyA-Gene aus CFT073 oder die komplementäre DNA (cDNA), die für Nectin-2 kodiert, wurden durch PCR amplifiziert und in pET-28a ( + ) kloniert, um aktive FLAG- oder HA-markierte rekombinante HlyA- oder Nectin-2-Proteine herzustellen. Zur Herstellung von inaktivem FLAG-gekennzeichnetem HlyA (pro-HlyA) wurde das hlyA-Gen ohne hlyC aus CFT073 in pET-28a ( + ) an XbaI- und XhoI-Enzymstellen kloniert. Myc-markiertes Nectin-2 wurde zur Transfektion in den pLenti-Hygro-Vektor integriert.
HlyA, pro-HlyA und humanes Nectin-2 rekombinante Proteinexpression und Reinigung
Die Expression von rekombinantem HlyA oder pro-HlyA wurde in E. coli BL21 (DE3) durchgeführt, die Expression von Nectin-2 in Rosetta (DE3). Vor der Induktion mit 100 μM IPTG wurden die Bakterien bei 37 °C kultiviert, bis sie eine OD600 von 0,6 bis 0,8 erreichten. Die kultivierten Bakterien wurden nach 12 Stunden Induktion bei 16 °C in LB mit IPTG durch Zentrifugation (8000 × g für 5 min bei 4 °C) gesammelt. Die Bakterien wurden mit Lysozym und Ultraschall lysiert und der Überstand wurde zentrifugiert, um Partikel zu entfernen (18.000 × g für 30 min bei 4 °C). Die Proteine wurden dann mit dem Ni-NTA-Reinigungssystem (GenScript, Nanjing, China) aufgereinigt. Die Proteine wurden mit 250 mM Imidazol eluiert. Die Fraktionen mit den HlyA-Fragmenten wurden gepoolt, in 150 mM Imidazol, 50 mM Imidazol und zweimal mit PBS dialysiert. Anschließend wurden die Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, mit Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten (Millipore, Burlington, MA, USA) auf 500 μl konzentriert. Der letzte Dialysepuffer, der ein ähnliches ionisches Milieu wie das gereinigte HlyA-Protein aufwies, wurde als Kontrolle für das gereinigte Protein in den Experimenten verwendet. Die endgültige Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit dem BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific) bestimmt.
Maus-Pyelonephritis-Modell
Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Tianjin Medical University, Tianjin, China, geprüft und genehmigt. Wir haben uns bemüht, das Leiden der Tiere so gering wie möglich zu halten und die Zahl der verwendeten Tiere zu reduzieren. Weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden von der Academy of Military Medical Science (Beijing, China) erworben. Das Mausmodell für akute Pyelonephritis wurde wie zuvor beschrieben erstellt.53 Die Bakterien wurden über Nacht in statischem LB-Medium bei 37 °C kultiviert. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 °C) pelletiert und in PBS resuspendiert, um eine Dichte von 2 × 1010 KBE/ml zu erreichen. Im Abstand von 3 Stunden wurden anästhesierte weibliche C57BL/6J-Mäuse zweimal intraurethral mit 50 μl UPEC-Stämmen (109 KBE) inokuliert.54,55 Nach 12, 24 und 48 Stunden wurden die Mäuse getötet und ihre Nieren aseptisch entfernt und in 1 ml PBS mit 0,025 % Triton X-100 homogenisiert und anschließend für die Bakterienauszählung seriell verdünnt. Nach 24 Stunden wurden die Nierengewebe auch für die Durchflusszytometrie, die Histologie und die Analyse proinflammatorischer Zytokine verwendet.
Durchflusszytometrie-Analyse
Einzellige Zellsuspensionen wurden durch Verdau mit 1,5 mg/ml Kollagenase IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 100 ng/ml DNase I in PBS für 30 Minuten bei 37 °C unter leichtem Schütteln hergestellt. Die verdauten Zellsuspensionen wurden dann durch ein 70-μm-Zellsieb (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) filtriert, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten. Die Fc-Rezeptoren wurden mit CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA) blockiert, und die Einzelzellsuspensionen wurden anschließend mit den folgenden Antikörpern inkubiert: Anti-CD11b konjugiert zu APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), Anti-Ly6G konjugiert zu PE (127608, Biolegend), Anti-F4/80 konjugiert zu FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), Anti-CD11c konjugiert zu PE (127608, Biolegend), Anti-CD206 konjugiert zu PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Die Zellen wurden auf einem FACSCanto II-Durchflusszytometer (BD Biosciences) mit der Flow Jo-Software (FlowJo, Ashland, OR, USA) analysiert.
H&E-Färbung und Immunhistochemie
Die Nieren wurden mindestens 24 Stunden lang in 10 % phosphatgepuffertem Formalin fixiert. Das fixierte Gewebe wurde dann in Paraffin eingebettet und in 5-μm-Schnitte geschnitten. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die histopathologischen Veränderungen der Niere wurden anhand einer 6-Punkte-Skala bewertet, wobei 0, 1, 2 und 3 normale, leichte, mäßige und schwere histologische Läsionen anzeigten (die pathologischen Schäden befanden sich hauptsächlich in der Medulla und an der kortikal-medullären Verbindung); 4, 5 und 6 hingegen zeigten leichte, mäßige und schwere histologische Läsionen an (die pathologischen Schäden befanden sich hauptsächlich in weiteren Teilen der Niere). Die histologischen Untersuchungen wurden von zwei Personen analysiert, die gegenüber den Versuchsgruppen verblindet waren.56,57 Für die immunhistochemische Analyse wurden die Schnitte mit dem Anti-Nectin-2-Antikörper (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA) gefärbt. Die Bilder wurden unter einem Mikroskop (BX46, Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen.
Immunfluoreszenzanalyse von Geweben und Zellen
Die Nieren wurden in OCT-Mittel mit flüssigem Stickstoff eingebettet. Die gefrorenen Blöcke wurden in 5-µm-Schnitte geschnitten, 1 h lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet und 10 min lang mit kaltem Aceton fixiert. Die gefrorenen Schnitte wurden dann sofort für 20 Minuten in Methanol und anschließend für 10 Minuten in Methanol mit 3 % Wasserstoffperoxid eingelegt. Die Gewebe wurden 1 Stunde lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und bei Bedarf über Nacht bei 4 °C mit dem Anti-F4/80-Antikörper (ab6640, Abcam, 1:200), dem Anti-Ly6G-Antikörper (ab210402, Abcam, 1:200) und dem Nektin-2-Antikörper (ab135246, Abcam, 1:200) in Blocking-Puffer inkubiert. Die Objektträger wurden dann fünfmal mit PBS gewaschen und mit Alexa Fluor 488/549-markierten Sekundärantikörpern (Proteintech, 1:200) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Visualisierung der Zellkerne wurden die Gewebeschnitte mit DAPI gegengefärbt. Die Bilder wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus) aufgenommen. Die mit pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 transfizierten 293T-Zellen wurden auf einem Lab-Tek-Deckglas gezüchtet und 6 Stunden lang mit 75 nM HlyA behandelt, 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und über Nacht bei 4 °C mit Anti-MYC-Tag-Antikörpern (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) und HA-Tag-Antikörpern (2367S, 1:200, CST) immunfluoreszenzgefärbt. Die Zellen wurden mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (FV1000-D, Olympus) abgebildet.
Infektion von Nierenepithelzellen mit UPEC-Stämmen
Humane Nierenepithelzellen (786-O oder HK-2) wurden 24 Stunden vor der UPEC-Infektion in 24-Well-Platten ausgesät. Für die ADAM10-Inhibition wurden die Zellen vor der Infektion 20 Stunden lang mit dem ADAM10-Inhibitor GI254023X (Sigma-Aldrich) inkubiert. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit Bakterien der angegebenen Infektionsmultiplikation (MOI) infiziert oder 12 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen von gereinigtem HlyA oder pro-HlyA stimuliert. In einigen Versuchen wurden die Zellen mit ∆hlyA (MOI 0.01) und gereinigtem HlyA (75 nM) behandelt. Für den Invasionstest wurden die Zellen nach 6-stündiger Infektion fünfmal mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang mit 200 μg/ml Gentamicin behandelt, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und mit 500 μl 0,2 % Triton X-100 in PBS lysiert und zur Auszählung der intrazellulären Bakterien auf LB-Agarplatten plattiert.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
GM-CSF-Konzentrationen im Überstand von infizierten 786-O-Zellen, HlyA/pro-HlyA-behandelten 786-O-Zellen oder homogenisierten Nieren nach der Infektion wurden mit einem ELISA-Entwicklungskit (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Nieren von Mäusen wurden entnommen und in PBS mit 1 % Triton X-100 und kompletten Mini-EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten (11697498001, Roche, Indianapolis, IN) homogenisiert. Die Homogenate wurden dann 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und 10 Minuten lang bei 10.000 × g bei 4 °C zentrifugiert; die Überstände wurden gesammelt und für den ELISA-Test von GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 und MIP-2 gemäß den Anweisungen des Herstellers (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) verwendet.
Zytotoxizitätstests
Zellkulturüberstände von 786-O-Zellen, die 12 Stunden lang mit gereinigten Proteinen oder Dialysepuffer behandelt wurden, wurden gesammelt und mit einem CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (G1780, Promega, Madison, WI, USA) auf Laktatdehydrogenase (LDH) untersucht.
Urinproben von Patienten
Urinproben wurden von Patienten entnommen, die mit UPEC-Stämmen infiziert waren und im Zweiten Krankenhaus der Medizinischen Universität Tianjin behandelt wurden, und das Vorhandensein des hlyA-Gens im UPEC-Stamm, der aus dem Urin der einzelnen Patienten isoliert worden war, wurde mittels PCR bestimmt (ergänzende Tabellen S2 und S4). Der Urin wurde mit Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten (UFC901024, Millipore) auf 200 μl konzentriert, und die konzentrierte Flüssigkeit wurde dann mit einem ELISA-Entwicklungskit (Neobioscience Technology Company) nachgewiesen. Die Studien im Zusammenhang mit Patientenproben wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt, und von allen Patienten wurde die schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.
RNA-Extraktion und qRT-PCR
786-O-Zellen wurden 4 h lang mit CFT073, ∆hlyA oder ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) infiziert. Die RNA wurde mit einem Total RNA Extraction Kit (Solarbio, Beijing, China) gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert und mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) revers transkribiert. qRT-PCR wurde mit einem FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche, Basel, Schweiz) auf einem 7900 Fast Real-Time PCR System (Roche) durchgeführt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren 95 °C für 5 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 20 s, 60 °C für 20 s und 72 °C für 20 s. β-Actin wurde als endogene Kontrolle verwendet und die Daten wurden auf der Grundlage des Transkriptionsniveaus von β-Actin im Wildtyp normalisiert und unter Verwendung der vergleichenden kritischen Schwellenwert-Zyklus 2-∆∆Ct-Methode quantifiziert. Die verwendeten Primer sind in der ergänzenden Tabelle S4 aufgeführt.
Chemotaxis-Assays
Zellmigrationsassays wurden mit Transwell-Kammern (Porengröße 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA) durchgeführt. THP-1-Zellen (2 × 106 in 200 μl) wurden in serumfreiem RPMI 1640-Medium resuspendiert und in die obere Kammer gegeben. Der Überstand aus infizierten 786-O-Zellen wurde mit 1 μg/ml neutralisierendem Antikörper gegen humanes GM-CSF (502203, BVD2-23B6, Biolegend) oder Kontroll-IgG2a (400515, Ratten-IgG2a, Biolegend) versetzt und 30 Minuten lang inkubiert. Dann wurden 600 μl des Mediums mit dem Überstand als Chemoattraktionsmittel in die untere Kammer gegeben. Nach 3 bzw. 6 Stunden Inkubation bei 37 °C in einer 5%igen CO2-befeuchteten Atmosphäre wurden die migrierten Zellen in der unteren Kammer gezählt.
Clodronat-Liposomen und Anti-GM-CSF-Antikörperbehandlung
Um Makrophagen zu eliminieren, wurden Mäusen 24 Stunden vor der Infektion 200 µl PBS oder Clodronat-Liposomen intravenös verabreicht.32,33 Um GM-CSF zu neutralisieren, wurde den Mäusen 1 h vor der Infektion ein neutralisierender Antikörper gegen GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) oder Kontroll-IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) intravenös injiziert.33,58
Antikörper und Western Blotting
Antikörper wurden von den folgenden Firmen bezogen: monoklonaler anti-FLAG-Antikörper (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag-Antikörper (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA) und anti-Nectin-2-Antikörper (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). Ganzzell-Lysate wurden mit RIPA-Lysepuffer (Millipore) und vollständigen Proteaseinhibitoren (Roche, Basel, Schweiz) hergestellt. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) verwendet. HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) oder Anti-Maus-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) wurden zum Nachweis der Antikörperbindung verwendet. Die immunreaktiven Komplexe wurden mit Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) nachgewiesen und mit einem GE Amersham Imager 600 belichtet.
Far-Western-Blotting und LC-MS/MS-Analyse
Das Far-Western-Blotting-Protokoll wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.59 786-O-Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, und die Zellmembranproteine wurden mit einem Membran- und Zytosolprotein-Extraktionskit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die löslichen membranassoziierten Proteine wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf 10%igen Gelen analysiert. Die Proteine wurden dann auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) übertragen. Die übertragenen Proteine wurden mit AC-Puffer renaturiert, indem die Guanidin-HCl-Konzentration schrittweise verringert wurde.59 Anschließend wurde die Membran 1 h lang mit 5 % Magermilch im TBST-Puffer blockiert. Danach wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit 30 μg/ml gereinigtem FLAG-tagged HlyA oder Dialysepuffer inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran mit einem 1:1000 verdünnten Anti-FLAG-Antikörper (Sigma-Aldrich) über Nacht bei 4 °C in 5 % Magermilch in TBST-Puffer inkubiert. Dann wurde die Membran gründlich gewaschen und mit HRP-konjugiertem Anti-Maus-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich)
Die Differenzbanden zwischen der Dialysepuffergruppe und der FLAG-markierten HlyA-Gruppe wurden mittels LC-MS/MS identifiziert, die mit einem nanoLC-LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer (Thermo, San Jose, CA, USA) in Verbindung mit einem Eksigent nano LC 1D plus HPLC-System von Majorbio (Shanghai, China) durchgeführt wurde. Die tryptischen Peptide wurden vollständig enzymatisch verdaut und mittels Nano-Elektrospray-Ionisierung ionisiert.33 Die Daten wurden anhand eines Full-Scan-Massenspektrums (300 bis 1800 m/z) analysiert. Schließlich wurden die MS-Daten mit Proteome Discoverer (Version 1.4.0.288, Thermo Scientific) analysiert.
RNA-Interferenz und Nectin-2-Überexpression
Small-interfering RNAs (siRNAs) für die Zielgene und eine verschlüsselte Kontroll-siRNA (siScr) wurden von GenePharma (Shanghai, China) synthetisiert. Die siRNAs wurden mit Lipofectamine 3000 (Invitrogen) in 786-O- oder HK-2-Zellen transfiziert. pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 wurde mit Lipofectamine 3000 (Invitrogen) in 786-O- oder HK-2-Zellen transfiziert, um Nectin-2 zu überexprimieren. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mittels Western Blotting auf ihre Proteinexpression untersucht. Die Sequenzen der siRNAs sind in der ergänzenden Tabelle S4 aufgeführt.
Immunopräzipitation
293T-Zellen wurden mit dem pLenti-Hygro-Vektor oder pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 transfiziert und dann 48 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden dann 6 Stunden nach der Transfektion mit FLAG-getaggtem HlyA (75 nM) inkubiert und frisch in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) für Western-Blotting- oder Immunpräzipitationstests (IP) lysiert. 786-O-Zellen wurden 6 Stunden lang mit FLAG-markiertem HlyA (75 nM) oder Dialysepuffer inkubiert und dann mit Lysispuffer für den Protein-IP-Assay lysiert. Die Zellüberstände wurden mit anti-FLAG M2 Beads (A2220, Sigma-Aldrich) oder anti-Myc M2 Beads (A7470, Sigma-Aldrich) für 12 h bei 4 °C für FLAG-tagged oder Myc-tagged Protein IP inkubiert. Für die Nectin-2-Protein-IP wurden die Zellüberstände 12 Stunden lang bei 4 °C mit dem Anti-Nectin-2-Antikörper (ab135246, Abcam) inkubiert und anschließend 2 Stunden lang bei 4 °C mit Protein A/G-Agarose (20241, Thermo Fisher) inkubiert. Normales Kaninchen-IgG (2729S, CST) wurde als Kontrolle verwendet. Nach der Inkubation wurden die Präzipitate durch Zentrifugation gesammelt, fünfmal mit dem Lysepuffer gewaschen und durch Immunoblotting mit monoklonalem anti-FLAG-Antikörper, anti-MYC-Tag-Antikörper oder anti-Nectin-2-Antikörper analysiert.
Bakteriell exprimiertes, gereinigtes rekombinantes FLAG-tagged HlyA (1 µg) wurde mit 1 μg bakteriell exprimiertem, gereinigtem rekombinantem Nectin-2 in Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20 % Glycerin, 1 % BSA) für 12 h inkubiert. Die Komplexe wurden dann einer FLAG-tagged Protein-IP oder Nectin-2 Protein-IP unterzogen. Schließlich wurden die komplexierten Proteine mittels Immunoblotting analysiert.
Statistische Analyse
Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mittels Varianzanalyse (ANOVA) getestet. Der nichtparametrische Mann-Whitney-Test wurde zur Berechnung der statistischen Signifikanz in den In-vivo-Experimenten verwendet.