Der His(15)-Rest im aktiven Zentrum des Histidin-haltigen Proteins HPr kann durch Aspartat ersetzt werden und immer noch als Phosphoakzeptor und Phosphodonor mit Enzym I bzw. Enzym IIA(Glucose) wirken. Andere Substitutionen, darunter Cystein, Glutamat, Serin, Threonin und Tyrosin, zeigten keine Aktivität. Enzym I K(m) für His(15) –> Asp HPr ist im Vergleich zum Wildtyp HPr um das 10-fache erhöht und V(max) ist um das 1000-fache verringert. Die Phosphorylierung von Asp(15) führte zu einer spontanen internen Umstrukturierung, bei der die Phosphorylgruppe und ein Wassermolekül verloren gingen, was durch Massenspektrometrie bestätigt wurde. Die gebildete Proteinspezies hatte einen höheren pI als His(15) –> Asp HPr, was auf die Bildung eines Succinimids oder eines Isoimids zurückzuführen sein könnte. Die Hydrolyse der isolierten Form mit hohem pI ergab nur Asparaginsäure am Rest 15, und es wurde keine Isoasparaginsäure nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass eher ein Isoimid als ein Succinimid gebildet wird. Bei fehlender Phosphorylierung konnte keine Bildung der Form mit hohem pI-Wert festgestellt werden, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung die Bildung der Zyklisierung katalysiert. Die mögliche Beteiligung von Asn(12) an einer internen Zyklisierung mit Asp(15) wurde durch die Asn(12) –> Ala-Mutation in His(15) –> AspHPr eliminiert. Asn(12)-Substitutionen von Alanin, Aspartat, Serin und Threonin in Wildtyp-HPr deuteten auf ein allgemeines Erfordernis von Rückständen hin, die in der Lage sind, eine Wasserstoffbindung mit dem Nepsilon(2)-Atom von His(15) zu bilden, aber die Beseitigung der Wasserstoffbindung hat nur eine 4-fache Abnahme von k(cat)/K(m) zur Folge.
Organisatorische Zugehörigkeit: 
Department of Biochemistry, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan S7N 5E5, Canada.
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