Abstrakt
U pacienta s uremií se po infekci tuberkulózou vyvinula hyperkalcemie a jeho hladiny ionizovaného vápníku korelovaly s hladinami 1,25-dihydroxyvitaminu D3 (1,25(OH)2D3). Provedli jsme další studie s cílem zjistit, zda jsou monocyty alternativním místem přeměny 1,25(OH)2D3 mimo renální tubulární buňky. Pomocí biologického testu ex vivo jsme v této studii zjistili, že aktivita 1-α-hydroxylázy (CYP27B1) v monocytech je významně vyšší u pacientů s aktivní tuberkulózou (TBC) než u pacientů s častým kontaktem s TBC. Když však byly monocyty pacientů s aktivní TBC restimulovány antigenem pocházejícím z Mycobacterium tuberculosis, bylo pozorováno méně 1,25(OH)2D3. Naopak u osob s častým kontaktem s TBC se hladina 1,25(OH)2D3 nezměnila. Došli jsme k závěru, že monocyty mohou být alternativním zdrojem 1-α hydroxylázy, která by mohla přeměňovat 25-hydroxyvitamin D3 na aktivnější 1,25(OH)2D3.
1. Úvod
Tuberkulóza sužuje svět již od prehistorických dob. Podle nedávné zprávy podlehne ročně tuberkulóze a souvisejícím komorbiditám jeden milion pacientů . V posledních desetiletích bylo vynaloženo obrovské úsilí na pochopení patofyziologického procesu tohoto onemocnění. Modely na zvířatech a studie na lidech otevřely cestu k objasnění individuálních imunitních reakcí na Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Tyto studie poskytují důkazy, že vitamin D hraje důležitou roli v odolnosti člověka vůči tuberkulóze. vitamin D se v boji proti tuberkulóze používá již více než 200 let. Olej z tresčích jater a kalciferol, hlavní zdroje vitaminu D, se používají od 17. století k léčbě pacientů s tuberkulózou . V normální fyziologii se po vystavení slunečnímu záření 7-dehydrocholesterol uložený v kůži přeměnil na previtamin D3 s následnou tepelnou izomerizací na vitamin D3 . Dále je vitamin D3 hydroxylován v játrech na 25-hydroxyvitamin D3 (25(OH)D3). Poté je 25(OH)D3 dále hydroxylován na nejaktivnější formu vitaminu D3, 1,25(OH)2D3, pomocí 1- hydroxylázy (CYP27B1) . Renální tubulární epiteliální buňky jsou hlavním zdrojem 1- hydroxylázy a hrají rozhodující roli při určování koncentrace 1,25(OH)2D3 v séru . Přítomnost CYP27B1 v extrarenálních tkáních je známa již několik desetiletí . Vliv extrarenálního CYP27B1 na koncentraci 1,25(OH)2D3 v séru dosud nebyl stanoven.
Setkali jsme se s 34letým pacientem s urémií, který byl 2 roky pravidelně hemodialyzován. Pacient pociťoval svalovou slabost s únavou po dobu 2 dnů před návštěvou rodinného lékaře. Chemické vyšetření krve odhalilo zvýšenou hladinu ionizovaného vápníku (5,44 mg/dl). Navzdory hyperkalcémii se pacientovy příznaky běžnou léčbou zmírnily. O čtyři měsíce později se u pacienta objevila progresivní svalová slabost doprovázená horečkou. Na pohotovosti byly opět zaznamenány zvýšené hladiny ionizovaného vápníku (6,88 mg/dl). EKG navíc odhalilo abnormální srdeční rytmus a krátký QT interval s rozšířenou T vlnou. Rentgenový snímek hrudníku ukázal infiltraci pravého horního plicního laloku, která byla později určena jako plicní tuberkulóza. Pacient poté podstoupil 9měsíční antituberkulózní léčbu. Čtyři měsíce po léčbě se u pacienta normalizovala hladina ionizovaného vápníku (5,2 mg/dl), přičemž došlo k úplnému vymizení příznaků. Abychom objasnili patogenezi hyperkalcemie tohoto pacienta, měřili jsme kromě hladiny ionizovaného vápníku také hladinu 1,25(OH)2D3. Jak ukazuje obrázek 1, hladiny 1,25(OH)2D3 vysoce korelovaly s hladinami ionizovaného vápníku.
Změny koncentrací ionizovaného vápníku a 1,25(OH)2D3 v séru pacienta s aktivní TBC a uremií.
Kromě renální exprese CYP27B1 jsou za důležitá extrarenální místa exprese CYP27B1 považovány makrofágy a monocyty. V této studii jsme hodnotili úlohu monocytů v metabolismu vitaminu D3 pomocí biologické zkoušky ex vivo. Dále jsme stimulovali monocyty antigenem odvozeným od MTB, abychom získali další poznatky o tom, jak monocyty modulují metabolismus vitaminu D3 v reakci na bakteriální výzvu.
2. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody
2.2. Materiály a metody Populace subjektů
Tato studie byla provedena na Lékařské univerzitě v Kaohsiungu. Účastníci byli rozděleni do dvou skupin: (1) s aktivní TBC a (2) s častým kontaktem s TBC. Osoby s aktivní plicní tuberkulózou potvrzenou kultivačním vyšetřením sputa a snímkem hrudníku byly zařazeny do skupiny s aktivní TBC (). Časté kontakty s TBC () zahrnovaly následující osoby: (1) zdravotnický personál, který pracoval v centru TBC nejméně 10 let a nikdy nebyl infikován, a (2) rodinní příslušníci pacientů s TBC, lékaři a zdravotní sestry, kteří byli dlouhodobě v kontaktu s pacienty s TBC a nikdy nebyli infikováni. Všichni častí kontaktéři s TBC byli očkováni BCG vakcínou a každoročně se podrobili rentgenovému vyšetření hrudníku; pokud byly snímky hrudníku abnormální, byl proveden Mantouxův test. Vyloučili jsme osoby s diabetem, malignitou nebo jakýmkoli jiným onemocněním, které by mohlo způsobit imunodeficit. Obě skupiny odpovídaly svým pohlavím a věkem (tabulka 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Doba trvání onemocnění byla definována jako interval od stanovení diagnózy do odběru krve. Délka expozice byla definována jako interval od zahájení práce v centru pro TBC do odběru krve. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2 Tabulka 1 Pohlaví a věk účastníků studie. Příprava buněk
Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány z krve ošetřené heparinem odebrané 2 skupinám dárců pomocí standardního gradientu Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). PBMC ( buňky/ml) byly resuspendovány v médiu RPMI 1640 doplněném L-glutaminem a 10% fetálním telecím sérem. Po inkubaci po dobu 1 hodiny v baňce o ploše 75 cm2 ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2 bylo médium obsahující neadherentní buňky dekantováno do kónické zkumavky a baňka byla dvakrát promyta médiem bez séra, aby se odstranily všechny zbytky neadherentních buněk. Adherentní monocyty byly odstraněny jemným seškrábnutím plastovou škrabkou na buňky. Buňky byly přeneseny do kónické zkumavky, odstředěny, aby se odstranil promývací roztok, a resuspendovány na počet buněk/ml v doplněném médiu. Populace adherentních buněk obsahovala více než 85 % CD14+ buněk.
2.3. Antigen
MTB izolovaný od pacientů s tuberkulózou byl resuspendován ve fosfátovém pufrovaném roztoku a tepelně usmrcen ve vodní lázni při 70 °C po dobu 70 minut. Bakterie byly poté sonikovány pomocí sonikátoru New Highway (Farmingdale, NY, USA). Koncentrace bílkovin v bakteriálním homogenátu byla stanovena pomocí soupravy Pierce BCA protein assay kit (IL, USA) a uložena při -20 °C.
2.4. Cytofluorometrická analýza
Cytometrická analýza byla provedena pomocí cytometru FACS (Becton Dickinson). Celkem byly buňky inkubovány s každou monoklonální protilátkou v nasyceném množství v 50 μl barvicího pufru (Hankův vyvážený solný roztok: 1 % BSA a 0,1 % azidu sodného) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté třikrát promyty PBS. Buňky byly připraveny k analýze suspenzí v 500 μl 1% paraformaldehydu v PBS. Populace monocytů byla vybrána pro analýzu na základě bodového grafu bočního a dopředného rozptylu. Pro každou analýzu bylo použito celkem 5 000 gated buněk. Gated buňky byly dále analyzovány pomocí fluorescenčního barvení s použitím fluorescein-isothiokyanátu (FITC-) konjugovaného s anti-CD14 (Ancell).
2.5. Kvantifikace 1,25(OH)2D3
Purifikované monocyty byly kultivovány v hustotě buněk/ml ve 100 μl v každé jamce 96jamkové destičky pro tkáňové kultury s 200 nM 25(OH)D3 rozpuštěného v konečné koncentraci 1 % ethanolu. Po 3 hodinách inkubace byl přidán 1 ml acetonitrilu k zastavení reakce. Buňky a médium byly odebrány a spojeny se stejným objemem methanolu k odstranění lipidů. Množství 1,25(OH)2D3 bylo stanoveno pomocí soupravy 1,25-dihydroxyvitamin D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). Krátce, 2 ml vody a 5 ml methanolu/vody (70 : 30) byly přidány do C18OH kazety k odstranění solí, polárních lipidů a pigmentů ve vakuu. Poté bylo do kazety C18OH přidáno 5 ml hexanu/methylenchloridu (90 : 10) k odstranění 25(OH)D3 a 5 ml hexanu/isopropanolu (99 : 1) k odstranění 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Každá C18OH kazeta byla těsně umístěna v křemíkové kazetě. Po přidání hexanu/isopropanolu (92 : 8) ve vakuu byla kazeta C18OH vyjmuta. Nakonec byl přečištěný 1,25(OH)2D3 eluován z křemíkové kazety v 5 ml hexanu/isopropanolu (80 : 20). Hladiny 1,25(OH)2D3 byly kvantifikovány kompetitivní radioimunoanalýzou (RIA) s použitím protilátek proti 1,25(OH)2D3 značených 125I a proti 1,25(OH)2D3.
2.6. Ošetření antigeny MTB
Monocyty ( buňky/ml) byly inkubovány s 10 μg/ml MTB a 200 ng/ml 25(OH)D3. Po 3 hodinách inkubace byl přidán 1 ml acetonitrilu k zastavení reakce. Výsledný 1,25(OH)2D3 byl přečištěn z buněk a média a kvantifikován pomocí RIA. Zbytek postupu byl stejný jako u předchozího stanovení.
2.7. Statistická analýza
Všechna data byla analyzována pomocí Studentova testu.
3. Výsledky
3.1. Koncentrace ionizovaného vápníku a 1,25 dihydroxyvitaminu D3 u pacienta s aktivní tuberkulózou a urémií
Ionizovaný vápník a 1,25(OH)2D3 v séru byly stanoveny v různých časových bodech od první návštěvy do jednoho roku po ukončení antituberkulózní léčby. Jak je znázorněno na obrázku 1, hladiny ionizovaného vápníku korelovaly s koncentrací 1,25(OH)2D3 (obrázek 1).
3.2. Studijní populace
Dvaceti pěti jedinců bylo zařazeno do skupiny s častým kontaktem s TBC a 25 pacientů do skupiny s aktivní TBC. Průměrný věk a poměr pohlaví se mezi skupinami významně nelišil. Charakteristiky souboru jsou uvedeny v tabulce 1.
3.3. Charakteristiky souboru jsou uvedeny v tabulce 1.
. Kvantifikace 1,25(OH)2D3
Monocyty byly kultivovány s 25(OH)D3 po dobu 3 hodin. Poté byl 1,25(OH)2D3 přečištěn z buněk a média a změřen pomocí RIA. Jak ukazuje obrázek 2, množství 1,25(OH)2D3 ve skupině s aktivní TBC bylo pg/ml (průměr ± SD), což bylo významně vyšší než ve skupině s častým kontaktem s TBC () (). Když byly monocyty současně inkubovány s MTB a 25(OH)D3 po dobu 3 hodin, množství 1,25(OH)2D3 ve skupině s aktivní TBC významně pokleslo ve srovnání se skupinou bez MTB ( a , resp.) () (viz obrázek 3). Ve skupině s častým kontaktem s TBC ( a , resp.) nebyl mezi monocyty s expozicí MTB a bez ní žádný rozdíl.
Kvantifikace 1,25(OH)2D3 u pacientů s aktivní TBC a častými kontakty s TBC. RIA měření 1,25(OH)2D3 purifikovaného ze suspenzí monocytů kultivovaných s 25(OH)D3 po dobu 3 hodin. Množství 1,25(OH)2D3 ve skupině pacientů s aktivní TBC bylo významně vyšší než ve skupině pacientů s častými kontakty s TBC. Každý sloupec představuje průměrnou hodnotu kvantifikace 1,25(OH)2D3. Chybové sloupce představují směrodatnou odchylku. *.
Kvantifikace 1,25(OH)2D3 u pacientů s aktivní TBC a častých kontaktů s TBC s antigenem M. tuberculosis (MTB) nebo bez něj. Monocyty byly pulzovány 25(OH)D3 s MTB nebo bez něj. Množství 1,25(OH)2D3 při expozici MTB významně pokleslo ve srovnání s množstvím bez MTB ve skupině s aktivní TBC. Každý sloupec představuje průměrnou hodnotu kvantifikace 1,25(OH)2D3. Chybové sloupce představují směrodatnou odchylku. *.
4. Diskuse
Zaznamenali jsme, že hladiny 1,25(OH)2D3 korelovaly s hladinami ionizovaného vápníku u pacienta s uremickou plicní tuberkulózou. Při aktivní plicní tuberkulóze byly sérové hladiny 1,25(OH)2D3 u tohoto pacienta vysoké, což následně vyvolalo vysoké hladiny ionizovaného vápníku. Po léčbě se hladiny 1,25(OH)2D3 i ionizovaného vápníku snížily. Teoreticky je u pacienta s uremií renální aktivita CYP27B1 triviální. U pacientů s uremií jsou často pozorovány nízké sérové hladiny 1,25(OH)2D3 . V souladu s tím, co bylo pozorováno u lidí, jsou u anefrického modelu myší rovněž pozorovány nízké hladiny 1,25(OH)2D3 . Extrarenální zdroj CYP27B1 je však popisován již více než 6 desetiletí. Harrell a Fisher byli jedni z prvních, kteří zjistili extrarenální syntézu 1,25(OH)2D3 za patologických podmínek . Tito autoři stanovili souvislost mezi dysregulovanou homeostázou vápníku a sarkoidózou. Později se ukázalo, že extrarenálním zdrojem produkce 1,25(OH)2D3 u těchto skupin pacientů jsou tkáňové makrofágy . Bylo zjištěno, že různé studijní skupiny exprimují CYP27B1 ve stále větším počtu tkání, jako jsou kožní melanocyty, tkáňové makrofágy a zbytkové buňky placenty . Překvapivě ne každá buňka, která exprimuje CYP27B1, má enzymatickou aktivitu . Abychom objasnili potenciál cirkulujících monocytů přispívat k vysokým hladinám 1,25(OH)2D3, použili jsme ke stanovení aktivity CYP27B1 biologickou zkoušku ex vivo s použitím 25(OH)D3 jako substrátu. Naše výsledky ukazují, že aktivita CYP27B1 v monocytech pacientů s aktivní tuberkulózou je výrazně vyšší než v monocytech jedinců s častým kontaktem s tuberkulózou. Cirkulující monocyty přispívají k přeměně 25(OH)D3 na aktivnější 1,25(OH)2D3. Je zajímavé, že vitamin D3 byl tradičně považován za endokrinní faktor; 1,25(OH)2D3 produkovaný na lokálních místech (ledvinové tubuly) je přenášen krví, aby ovlivnil další tkáně nebo orgány, například kosti. V posledních desetiletích se však ukázalo, že vitamin D3 plní i jiné než endokrinní funkce. 1,25(OH)2D3 produkovaný zánětlivými buňkami může stimulovat expresi receptorů pro vitamin D v sousedních buňkách i v samotných zánětlivých buňkách. Vazbou na receptor vitaminu D a retinoidní receptor se komplex ligand-receptor může vázat na promotory mnoha zánětlivých genů . Vzhledem k těmto účinkům se mělo za to, že vitamin D3 má jak parakrinní, tak autokrinní funkci. Na rozdíl od endokrinní funkce vitaminu D3 jako regulátoru vápníku jeho parakrinní a autokrinní funkce podněcují zánětlivé buňky k produkci antibakteriálních peptidů a zvyšují proces autofagie . Protože 1,25(OH)2D3 je produkován lokálně a není přenášen do cílových míst regulace homeostázy vápníku, jeho produkce neovlivňuje sérové hladiny vápníku. Zajímavé je, že v této studii jsme zjistili, že 1,25(OH)2D3 produkovaný monocyty je zvláštním případem. Ačkoli 1,25(OH)2D3 produkovaný monocyty může působit lokálně, jsou tyto buňky roznášeny krví do tkání v celém těle. 1,25(OH)2D3 produkovaný monocyty se také chová jako endokrinní faktor. Monocyty jsou možná jediné buňky v našem těle, které mohou organizovat endokrinní, parakrinní a autokrinní funkce vitaminu D3. Zajímavou otázkou je, jaký je relativní podíl monocytového zdroje 1,25(OH)2D3 na celkové hladině 1,25(OH)2D3. Dusso et al. pozorovali, že maximální produkce 1,25(OH)2D3 z monocytů je triviální (ve fmolech/hodinu/mikrogram DNA) ve srovnání s koncentrací 1,25(OH)2D3 v normě (v pmol/ml) . Údaje však pocházejí z experimentu ex vivo, nevíme, kolik monocytů v těle je stimulováno k produkci 1,25(OH)2D3. Předpokládáme, že relativní podíl monocytového zdroje 1,25(OH)2D3 na celkové hladině 1,25(OH)2D3 je za většiny okolností malý. Dokonce i u pacientů s granulomatózním onemocněním má jen málo z nich klinické příznaky hyperkalcemie v důsledku vysoké hladiny 1,25(OH)2D3. Náš indikační případ je jedním z nich.
Zjistili jsme také, že při kultivaci monocytů pacientů s aktivní TBC s antigenem MTB je přeměna 1,25(OH)2D3 významně nižší než bez přidání antigenu. Ve skupině s častým kontaktem s TBC nebyl rozdíl mezi tím, zda byly s antigenem MTB nebo bez něj. Pro toto pozorování existují dvě možná vysvětlení. Za prvé, primed monocyty od pacientů s aktivní TBC mohou při další stimulaci MTB antigenem indukovat větší aktivitu 24(OH) hydroxylázy (CPY24) než jejich protějšky, které aktivně hydroxylují 1,25(OH)2D3 na kyselinu kalcitronovou. vitamin D3 indukuje nejen zánětlivé genové produkty, ale také expresi CPY24 . CPY24 je hlavním katabolickým enzymem vitaminu D3. Aktivity CYP27B1 a CYP24 jsou modulovány diametrálně odlišným způsobem za účelem kontroly sérových hladin 1,25(OH)2D3 . Díky tomuto společnému působení je u pacientů zřídka pozorována hyperkalcemie. U skupiny s častým kontaktem s TBC bylo prokázáno ještě lepší sladěné působení, a proto po stimulaci antigenem MTB nedošlo ke změně přeměny 1,25(OH)2D3. Druhým vysvětlením je, že aktivita CPY27B1 se vyčerpá, když jsou monocyty restimulovány MTB antigenem.
Exprese mRNA nebyla v této studii stanovena z následujících důvodů. Za prvé, pro biologickou zkoušku ex vivo bylo zapotřebí velké množství monocytů od účastníků. Pokud bychom provedli jak kvantitativní expresi mRNA, tak biologickou zkoušku ex vivo, museli bychom od každého účastníka odebrat více než 30 ml krve. Odběr takového objemu krve byl naší etickou komisí zamítnut. Za druhé, jak bylo uvedeno dříve, některé tkáně mohou exprimovat CYP27B1 bez detekovatelné enzymatické aktivity. mRNA hladiny nejsou vždy v korelaci s enzymatickou aktivitou. Navzdory expresi CYP27B1 v některých tkáních nebyla zjištěna žádná enzymatická aktivita. V budoucích studiích by měly být kvantifikovány hladiny CYP27B1 a CYP24 a metabolitů vitaminu D3, jako je kyselina kalcitronová a 24,25(OH)2D3, aby se objasnil metabolismus vitaminu D3 v patofyziologickém procesu tuberkulózy.
5. Závěr
Závěrem lze říci, že hladiny vápníku korelovaly s hladinami 1,25(OH)2D3 u pacienta s uremickou infekcí tuberkulózou. Dále jsme zjistili, že aktivita CYP27B1 v monocytech je vyšší u pacientů s aktivní tuberkulózou než u pacientů s častým kontaktem s tuberkulózou.
Etické schválení
Tento studijní projekt byl schválen Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Hospital. Číslo schválení je KMUH-IRB-20130103.
Střet zájmů
Autoři prohlašují, že u tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.
Příspěvek autorů
Yi-Ching Tung a Wen-Chan Tsai provedli experimenty a napsali článek. Tsan-Teng Ou a Wen-Chan Tsai navrhli studii a shromáždili vzorky. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi článku.