Linie drozofil
Několik linií (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP a UAS-tdTomato) byly získány z Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) a MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) poskytl B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD) a DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) poskytl G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generace konstruktu Act88F:Rpr a mušek
Kmeny Actin88F:Rpr (mušky Act88F:Rpr) byly vytvořeny pomocí konstruktu Actin88F:eGFP29. Linie Act88F:GFP, která obsahuje konstrukt eGFP řízený 2053 bp oblastí promotoru actin88F, byla získána od R. Bentona (University of Lausanne). Konstrukt Act88F:Rpr byl vytvořen tak, že se nejprve pomocí následujícího páru primerů přidalo restrikční místo KpnI na 5′ konec klonu rpr cDNA (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) a místo XbaI na 3′ konec otevřeného čtecího rámce pomocí soupravy QuikChange Site-directed mutagenesis (Agilent Technologies):
Přední primer 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Reverzní primer 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGCTT 3′
Konstrukt Rpr byl poté včleněn do Act88F:eGFP za promotor Act88F na místo sekvence eGFP. Konstrukt Act88F:Rpr byl vpraven do embryí Drosophila attp18 pro integrázou PhiC31 zprostředkovanou transgenezi specifickou pro dané místo35 (cytolokace místa přistání transgenu 6C12) společností BestGene Inc. (Chino Hills, Kalifornie). Pro některé experimenty byl tento transgen kombinován s transgenem UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (vytvořeným v laboratoři M.H.D.).
Bylo provedeno fluorescenční zobrazování nepřímých letových svalů
Fluorescenční mikroskopie polodrážek36,37 . Stručně, mouchy byly anestetizovány a poté jim byla odstraněna hlava a břicho. Thorace byly přes noc fixovány ve 4% paraformaldehydu při 4 °C a následující den opláchnuty v 1× fosfátovém pufru (PBS). Vzorky byly uspořádány na skleněném sklíčku, zmrazeny v tekutém dusíku a rozříznuty v midsagitální rovině pomocí žiletky. IFM byly obarveny faloidinem Alexa-Fluor 568 (1:100 v PBS s 0,1% Triton-X (PBST)) přes noc při 4 °C, opláchnuty PBS a vizualizovány pomocí systému EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) při zvětšení ×4. Pro celoplošné zobrazení myofibril IFM byly mouchy připraveny a toraky rozděleny podle výše uvedeného popisu. Hemi-thoraces byly obarveny faloidinem Alexa-Fluor 568 (1:100 v PBST) přes noc při 4 °C. Vzorky byly opláchnuty v PBS, namontovány pomocí Vectashield (Vector Laboratories) a vizualizovány pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) při 100násobném zvětšení.
Imnofluorescenční zobrazování mozků a ventrálních nervových provazců
Mozky a VNC byly vypreparovány z 2-3 dpe samic mušek v PBS. Tkáně byly poté fixovány po dobu 20 minut ve 4% paraformaldehydu v PBS při pokojové teplotě. Po fixaci byly mozky a VNC 2-3krát promyty v PBS s 1% Triton-X-100 (PBST) vždy po dobu 10 min a poté inkubovány při 4 °C přes noc v PBST. Poté byly vzorky umístěny do PBST s 5% normálním kozím sérem (PBSTS) na 20 min při pokojové teplotě. Poté byly inkubovány s primárními protilátkami (králičí anti-GFP v poměru 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; myší anti-Bruchpilot/nc82 v poměru 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) zředěnými v PBSTS po dobu 48 h při 4 °C. Mozek a VNC byly 2-3krát opláchnuty v PBST vždy po dobu 10 min před inkubací se sekundárními protilátkami (kozí proti králičí sekundární protilátka konjugovaná s Alexa 488 v poměru 1:500; Thermofisher; kozí proti myší sekundární protilátka konjugovaná s Alexa 633 v poměru 1:500; Thermofisher) zředěnými v PBSTS po dobu 48 h při 4 °C. Nakonec byly mozky a VNC 2-3krát opláchnuty po dobu 10 min v PBST a upevněny na sklíčka s můstkovými krycími sklíčky v montážním médiu Slowfade (Thermofisher).
Vzorky byly zobrazeny pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu Carl Zeiss LSM 700 s následujícím nastavením: Zvětšení ×20, 8bitový dynamický rozsah, 2× průměrování obrazu, velikost pixelu 0,52 × 0,52 μm, interval z-kroku 0,57 μm. Standardní odchylka z-projekce zobrazovaných objemů byla provedena pomocí programu Fiji38. Pro porovnání exprese GFP v centrální nervové soustavě byly intenzita laseru a zisk PMT pro zelený kanál u vzorků divokého typu, A1 > GFP a Act88F:GFP konstantní.
Zobrazení exprese GFP ve svalech nohou
Nohy byly ručně vypreparovány v místě tělního kloubu a připevněny na skleněná sklíčka pomocí oboustranné pásky. Do prostoru mezi krycím sklíčkem a sklíčkem bylo poté přidáno montážní médium Slowfade (Thermofisher). Poté jsme zaznamenali fluorescenci GFP v zeleném kanálu pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu LSM 700 (Zeiss). Intenzita laseru, zisk PMT a parametry skenování byly u divokého typu, MHC > GFP a Act88F:GFP konstantní: Zvětšení ×20, 8bitový dynamický rozsah, průměrování obrazu ×8, velikost pixelu 0,63 × 0,63 µm a interval kroku z 10 µm. Kutikulární autofluorescence byla rovněž zaznamenána v červeném kanálu.
Pitva hrudníku pro zobrazování VNC
Vlastní držáky používané k upevnění mušek během zobrazování byly vyrobeny podle předchozího popisu39. Pro zobrazování VNC byly tyto stupnice upraveny tak, aby měly (i) ploché, nikoliv skládané ocelové podložky, a (ii) zkosené vrcholy, aby byl sférický běhoun viditelný pro optické snímače průtoku (Shapeways, „file“). Ocelové podložky byly vyrobeny z 0,001″ nerezové oceli typu 316 žíhané na měkko (McMaster-Carr, díl č. 2317K11). Podložky byly vyleptány (Etchit, Buffalo, MN), aby se vytvořily obdélníkové otvory, jak je vysvětleno „zde“. Soubor s návrhem podložek naleznete „zde“.
Všechny experimenty byly prováděny na 1-3 dpe samicích mušek chovaných při 25 °C na standardní potravě z kukuřičné mouky v cyklu 12 h světlo:12 h tma. Mouchy byly anestetizovány při 4 °C. Byla vybrána samička mouchy a v některých případech jí byla zastřižena křídla, aby se zjednodušil proces montáže. Hřbetní část hrudníku mouchy byla poté prostrčena otvorem v ocelové podložce zobrazovacího stolku. Stupeň byl poté převrácen, lepidlo vytvrzující UV zářením (Bondic, Aurora, ON Kanada) bylo opatrně naneseno po obvodu hrudníku a vytvrzeno UV osvětlením (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). UV lepidlo bylo poté použito k upevnění hlavy a břicha na spodní stranu jeviště. Poté bylo jeviště naplněno mimobuněčným fyziologickým roztokem18. Pod pitevním mikroskopem s velkým zvětšením (Leica M165C) byla podkožní jehlou (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) naříznuta a zvednuta kutikula z hřbetní části trupu40 , přičemž bylo třeba dávat pozor, aby nebylo přerušeno krční vazivo. Následně byly u zvířat bez Act88F:Rpr tupými kleštěmi odstraněny IFM, převážně z anteriorně-mediální oblasti hrudníku nad střevem (tento krok není u zvířat Act88F:Rpr nutný). Tímto postupem se odhalí hřbetní povrch proventrikula – velké baňaté střevní struktury. S velkou opatrností pak byly použity velmi jemné kleště k uchopení a nadzvednutí proventrikula, aby se většina střeva (včetně plodnic a slinných žláz) odsunula od ventrálněji umístěné nervové tkáně. Když bylo střevo takto vyzdviženo, byly použity ultrajemné nůžky (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) k jeho protnutí v nejpřednější části. Proventriculus byl poté odklopen a zadním řezem byly tyto části střeva zcela odstraněny, čímž byla odhalena pod nimi ležící nervová tkáň. Je pozoruhodné, že při této disekci se odstraní také aorta, čímž se omezí tok hemolymfy z břišní hřbetní cévy. Přesto jsme zjistili, že mouchy byly životaschopné a chovaly se až 4 h. V některých případech jsme pozorovali, že střevní nebo svalová tkáň začala během zobrazování zakrývat VNC. Proto je třeba v této fázi odstranit volnou tkáň a zároveň dávat velký pozor, aby nedošlo k přerušení VNC. Po každé pitvě jsme zkoumali, do jaké míry zvíře pohybovalo nohama v reakci na závan vzduchu nebo uchopilo každou nohou nějaký předmět. To se ukázalo jako přesný ukazatel úspěšnosti preparace. Pro hodnocení kvality pitvy jsme zkoumali pohyby každé nohy na kulovém běhounu. Pokud se moucha dokázala pohybovat koordinovaně, byla pitva považována za úspěšnou. V opačném případě bylo zvíře klasifikováno jako zvíře s nedostatkem pohybu končetin. Zvířata s více nefunkčními končetinami byla kategorizována jako neschopná.
2-fotonová mikroskopie během chování
Experimenty byly prováděny ve večerním Zeitgeberově čase (Z.T.) a zvířata byla obvykle snímána 30-60 min po pitvě. Držáky much byly upevněny na vyvýšené plošině nad sférickým běhounem (doplňkový obr. 3a). VNC pak byla lokalizována pomocí okulárů mikroskopu a umístěna do středu zorného pole pomocí dvoufotonového zobrazování.
Sférický běhoun je hliníková tyč s kulovitým otvorem vyfrézovaným na jednom konci22. Vyrobili jsme pěnové kuličky o průměru 10 mm (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) a ručně jsme je bodově označili pomocí pera Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA), abychom získali vysoce kontrastní prvky pro měření optického toku. Proud 500-600 ml min-1 filtrovaného a zvlhčeného vzduchu procházel držákem pomocí digitálního regulátoru průtoku (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Pohyby kuličky byly měřeny pomocí dvou optických snímačů průtoku (ADNS3080) vybavených objektivy se zoomem (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). Kulička a moucha byly osvětleny pomocí dvojice IR LED diod (špičková vlnová délka 850 nm) spojených s optickými vlákny a kolimátorovými čočkami (ThorLabs, Newton, NJ USA). Měření optického toku byla předávána na desku mikrokontroléru (Arduino Mega2560), kde byla zaznamenávána pomocí vlastního kódu v jazyce Python. Současně byly pořizovány videozáznamy chování zvířat na míči pomocí IR citlivé firewire kamery (Basler, Ahrensburg, Německo) při rychlosti přibližně 30 snímků za sekundu.
Prováděli jsme dvoufotonovou mikroskopii pomocí mikroskopu Bergamo II (ThorLabs) vybaveného dvěma detektory GaAsP PMT pro zobrazování GCaMP6 a tdTomato a spojeného s Ti:safírovým laserem (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) naladěným na 930 nm. Použili jsme 20× objektiv Olympus s vodní imerzí a NA 1,0 (Olympus, Center Valley, PA USA). Mikroskop byl řízen pomocí softwaru ThorImage (ThorLabs). Experimenty se zobrazováním koronálních řezů byly prováděny v zobrazovacím režimu Galvo-Galvo při frekvenci 6-9 Hz. Tato snímková frekvence se měnila s velikostí obrazu, která se pohybovala mezi 26,58 × 26,58 µm a 53,15 × 53,15 µm. Výkon laseru se pohyboval mezi 3 mW a 5,7 mW. S vhodným hardwarem (např. galvorezonanční skener a piezoelektrický objektivový límec) je možné i objemové zobrazování.
Příležitostně byl k vyvolání chování při chůzi použit závan vzduchu. Tyto pufy byly digitálně kódovány (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Vlastní software ROS propojený prostřednictvím analogového výstupního zařízení (Phidgets, Calgary, Kanada) se softwarem ThorSync (ThorLabs) byl použit k synchronizaci měření optického toku, videografie chování, měření vzduchových pufů a získávání dvoufotonových snímků. Pro zobrazování koronálních řezů byl k řízení rychlých pohybů objektivu mikroskopu v ose z použit piezoelektrický límec (Physik Instrumente, Karlsruhe, Německo).
Pro porovnání nervové aktivity mezi kontrolními zvířaty a zvířaty Act88F:Rpr jsme pořizovali snímky o velikosti 512 × 512 pixelů při rychlosti 1,7 snímku za sekundu za použití konstantní intenzity laseru a zisku PMT. Vybrané oblasti zobrazování byly empiricky vybrány jako horizontální řezy sestávající z orientačních bodů pozorovaných v hloubce ~61-65 µm v doplňkovém filmu 1.
Srovnání chůze s disekcí nebo bez ní
Pro vyhodnocení vlivu disekce na lokomoci byla zvířata divokého typu podrobena následujícímu postupu. Zvířata byla nasazena na zobrazovací stupně a do každého stupně byl přidán fyziologický roztok. Pitvána byla pouze náhodná podskupina zvířat. Každá namontovaná moucha byla poté umístěna na sférický běžecký pás a její chování při chůzi bylo zaznamenáváno po dobu 30 minut. Optický tok byl zaznamenán, jak je popsáno výše. Pro zvýšení pravděpodobnosti lokomoce byl na tykadla mouchy nasměrován 500 ms pulz 100% CO2 s intervalem mezi pulzy 1 min (0,05 ln min-1 pomocí regulátoru hmotnostního průtoku; Vögtlin Instruments, Švýcarsko).
Infračervená laserová stimulace tykadel
Pro porovnání chování při chůzi mezi Act88F:Rpr a kontrolními zvířaty jsme stimulovali jejich tykadla 830 nm blízkým infračerveným laserem (Schäfter + Kirchhoff, Německo). Nejprve jsme anestetizovali 7-8 dpe samic při teplotě 4 °C a namontovali je na zobrazovací stupně. Poté byly mouchy aklimatizovány po dobu 10 min. Při každém experimentu obdrželo zvíře deset 2sekundových laserových stimulačních pulzů (18,1 mW) do pravé antény v intervalu 60 s mezi pulzy. Kontrolní zvířata a zvířata Act88F:Rpr byla testována střídavě, aby se minimalizoval vliv cirkadiánního času na srovnání chování.
Statistika
Velikosti vzorků pro pokusy na zvířatech byly zvoleny takto: provedli jsme nejméně tři pokusy pro ilustraci populačních a řídkých nervových záznamů a při statistických srovnáních jsme provedli více než deset pokusů na skupinu. Předem stanovené kritérium nízkého poměru signálu k šumu fluorescenčních signálů vedlo k odstranění dvou experimentů MDN z našeho souboru dat. Nebyla použita žádná randomizace ani zaslepení. V případě stimulace anténním laserem nebyla data normálně rozdělena, proto byly provedeny Friedmanův a Mannův-Whitneyho U-test. Odhady variability jsou prezentovány jako průměr a bootstrapované 95% intervaly spolehlivosti.
Analýza dat
Všechna data jsme analyzovali pomocí vlastních skriptů Python. Protože se frekvence sběru dat lišila u optického toku, videografie chování a dvoufotonového zobrazování, interpolovali jsme signály tak, aby odpovídaly signálům s nejvyšší frekvencí. Následně byla data o optickém toku vyhlazena pomocí průběžného průměru (okno = 200 ms) a poté převedena na rotace s-1 pro anteriorně-posteriorní, mediálně-laterální a yaw osu22. Aby byla tato měření intuitivnější, byly rotace s-1 následně převedeny na mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) pro pohyby anterior-posterior (vforward) a medial-lateral (vside) a na stupně s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) pro pohyby yaw (vrotation)22.
Analýza lokomoce u pitvaných zvířat (doplňkový obr. 2) byla provedena následovně. Údaje o optickém toku vpřed pro 20 disekovaných a 20 nedisekovaných mušek byly převzorkovány na 1500 bodů s-1 a vyhlazeny pomocí klouzavého průměru o trvání 0,2 s. Pro výpočet procenta času chůze dopředu/dozadu nebo chůze do strany byly empiricky definovány dva prahy, -0,31 mm s-1 a +0,31 mm s-1, které rozlišují mezi chůzí v klidu a chůzí dopředu (doprava), resp. dozadu (doleva). Hodnoty nad 0,31 mm s-1 byly považovány za momenty chůze vpřed (doprava) a hodnoty pod -0,31 mm s-1 za momenty chůze vzad (doleva). Hodnoty optického toku mezi těmito prahovými hodnotami byly považovány za okamžiky klidného stání. Procento času chůze bylo vypočteno jako podíl datových bodů, v nichž zvíře nebylo považováno za stojící. Podobně byly prahové hodnoty 10,8 a -10,8 stupně s-1 použity pro definování okamžiků otáčení. Jednání bylo definováno jako nepřetržitá doba chůze nebo otáčení.
Během chování mohlo dojít k velkým deformacím tkání. Proto jsme provedli post-hoc registraci pan-neuronového obrazu (obr. 2). Všechny snímky zobrazovacího experimentu jsme registrovali k jednomu referenčnímu snímku. Protože složitost deformací nebylo možné zachytit pomocí jednoduchých parametrických modelů pohybu (např. afinních transformací), použili jsme neparametrický, variační přístup, určený k modelování libovolně složitých deformací. Pole pohybu w mezi referenčním obrazem, označeným Ir, a obrazem v čase t, označeným It, jsme vypočítali řešením minimalizačního problému
kde D(w) je člen pro přizpůsobení dat, druhý člen je regularizace podporující vyhlazení w penalizací jeho gradientu ∇w41, Ω je diskrétní oblast obrazu a parametr λ vyrovnává příspěvky obou členů.
Snímky GCaMP6s představují výzvu pro odhad pohybu, protože nervová aktivita způsobuje velké lokální změny intenzity. Proto jsme použili další fluorofor nezávislý na aktivitě, tdTomato, a definovali jsme datový člen ve tvaru
První člen modeluje standardní předpoklad zachování intenzity podél trajektorie každého pixelu. Je definován vztahem
kde používáme normu \(\ell _1\), abychom získali částečnou robustnost vůči změnám intenzity42. Druhý člen v rovnici (2) je omezení shodnosti rysů inspirované Revaudem a spolupracovníky43 a zapsané jako
V rovnicích (2)-(4) jsou Ir a It z kanálu tdTomato. Minimalizace funkce ϕ upřednostňuje, aby vektory pohybu w(x) byly blízké korespondencím prvků m(x, Ir, It), vypočteným na řídké množině relevantních klíčových bodů. M získáme pomocí algoritmu shody rysů navrženého Revaudem a spolupracovníky43 , který je speciálně navržen tak, aby zvládal velké deformace obrazu. Výpočet m provádíme pomocí obrazového kanálu tdTomato, takže korespondence jsou rovněž necitlivé na změny intenzity mezi Ir a It. V důsledku toho se odhad řídí spolehlivými shodami rysů. Parametr γ vyrovnává oba členy rovnice (2).
Pro každý experiment jsme optimalizovali hodnoty λ a γ pomocí vyhledávání v mřížce pro registraci snímků horizontálních řezů VNC (doplňkový obr. 4). Jako objektivní funkci pro optimalizaci jsme použili gradient časového středního obrazu44. Malé hodnoty λ (tj. λ < 1000), občas vedly k artefaktům v registrovaných obrazech. Tyto artefakty byly spojeny se silnou konvergencí vektorového pole w(x) (doplňkový obr. 4c). Proto jsme empiricky definovali artefakty jako shluky pixelů s \({\mathrm{div}},{\mathbf{w}}levý( {\mathbf{x}} \pravý) < – 1,2\) a kardinalitou >20 (podobné výsledky jsme získali s kardinalitou >5). Nakonec jsme vybrali hodnoty λ a γ jako hodnoty bez artefaktů a s nejvyšším gradientem středního obrazu. Ukázky neregistrovaných obrazů, transformačních vektorových polí a registrovaných obrazů tří optimalizovaných příkladů jsou uvedeny v doplňkovém filmu 5.
Optimalizační úlohu v rovnici (1) jsme řešili algoritmem ADMM (alternated direction method of multiplier)45 . Zavedli jsme dvě rozdělovací proměnné, které jsou spojeny s regularizačními členy, respektive s členy pro porovnávání rysů. Každý dílčí problém algoritmu byl řešen analyticky. Použili jsme části knihovny inverzních úloh popsané v ref. 46. Následné zpracování založené na váženém mediánovém filtrování bylo provedeno metodou z47.
Na obr. 2 bylo chování poloautomaticky anotováno pomocí vlastního modulu Pythonu. Tento modul umožňuje uživateli vybrat dvě oblasti zájmu (ROI) na prvním snímku videa. První ROI slouží k detekci chůze a musí být umístěna nad metathorakální a mesothorakální nohou. Druhá oblast ROI je zodpovědná za detekci prothorakálních nohou a musí být umístěna před mouchou. Pro detekci pohybu v těchto oblastech se odečítají po sobě jdoucí snímky. Výsledné rozdílové snímky se poté mediánově rozostří (poloměr = 5 pixelů), aby se snížil šum. Na základě tohoto rozostřeného snímku se použije prahová hodnota počtu pixelů, které nejsou v každé z obou oblastí ROI, k extrakci binárních sekvencí hýčkání a chůze. Všimněte si, že pohyby hrudních končetin pozorované při chůzi jsou ignorovány (tj. klasifikace grooming je podřízena klasifikaci chůze). Poté byl použit hysterezní filtr k filtrování binárních sekvencí chování dolní propustí a k odstranění přechodů, které se vyskytují na příliš malém počtu snímků, aby byly biologicky věrohodné. Příklady ROI a behaviorálních anotací jsou znázorněny v doplňkovém filmu 6. Tato data o chování byla použita na obr. 2, jak ukazuje doplňkový film 2. Byla anotována pomocí následujících parametrů: práh pro chůzi = 400, práh pro grooming = 5, délka hystereze pro chůzi = 8, délka hystereze pro grooming = 10.
Pro obr. 2b, c jsme použili lineární regresi k nalezení oblastí ve VNC spojených s chůzí nebo groomingem. Regresory Xw a Xg (pro chůzi, respektive pro grooming) byly zkonstruovány ze dvou behaviorálních sekvencí, Sw a Sg, pomocí rovnice (5) konvolucí s exponenciálně se rozpadajícím signálem Calcium Impulse Response (CIR) odvozeným z časové konstanty naměřené pro GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Cílové funkce byly pixelové stopy ∆F/F, kde ∆F = Ft – F. Ft je fluorescence v čase t. F je základní fluorescenční signál měřený jako průměrná hodnota pixelu pro prvních deset po sobě jdoucích snímků GCaMP6s, na kterých nebyla pozorována žádná buněčná aktivita (tj, minimální a neměnná fluorescence GCaMP6s).
Váhy regresorů byly vypočteny pomocí rovnice (6).
kde y je pixelová stopa ∆F/F.
Obrázek 2b, c ukazuje tepelné mapy vah regresorů, ww pro chůzi a wg pro grooming, normalizované k jejich příslušným maximům. Jako oblast tepelné mapy byla vybrána ROI 1 s vysokou váhou pro grooming, ale nízkou váhou pro chůzi. ROI 2 byla vybrána jako prostorová lokalita s nejvyšší hodnotou ww. Každá ROI zahrnuje oblast o poloměru 15 pixelů.
Pro identifikaci zpracování řídkých neuronových obrazových dat (obr. 3-5) byly ROI nejprve vybrány pomocí vlastních skriptů Python, které závisely na knihovnách OpenCV a Numpy. K tomu byl vybrán referenční snímek, pro který software identifikoval všechny potenciální ROI. Za tímto účelem byl obraz GCaMP6s vyhlazen, aby se snížil šum pozadí, a poté byl na obraz aplikován prahový filtr Otsu. Na všechny objekty zjištěné na snímku byl poté aplikován faktor eroze. Obrysy všech detekovaných objektů byly poté předloženy uživateli k ručnímu výběru. Jakmile byly tyto referenční ROI vybrány pro levý a pravý neuron, použili jsme algoritmus registrace obrazu založený na křížové korelaci48 k identifikaci nejpravděpodobnějších levých a pravých ROI pro každý snímek obrazu na základě těch, které byly vybrány ručně na referenčním snímku. Druhý skript byl použit k ručnímu ověření automaticky vybraných ROI a v případě nesprávnosti k zobrazení všech potenciálních ROI v rámci snímku pro ruční výběr. Pokud hodnoty eroze poskytly chybné ROI, byl další skript použit k ručnímu umístění eliptických ROI s libovolnou orientací na daném snímku. Nakonec byly binární obrazy ROI použity jako obrazová maska k extrakci průměrných fluorescenčních signálů z původních obrazů GCaMP6s nebo tdTomato. Tyto signály byly uváděny jako %∆R/R jako v ref. 49, aby se snížil vliv pohybu na naše měření. Vzhledem k absenci podnětů byla základní linie R vypočtena jako minimální poměr GCaMP6s/tdTomato v rámci bin 2,5 s.
Pro detekci přechodného zvýšení aktivity jsme vyvinuli algoritmus založený částečně na ref. 50. Nejprve jsme určili, kdy první derivace signálu %∆R/R překročila prahovou hodnotu, která byla určena zkoumáním všech hodnot derivací pro danou třídu neuronů (MDN, MAN nebo A1). Vycházeli jsme z toho, že prahové hodnoty by měly být charakteristické a potenciálně odlišné pro každý typ neuronu, protože dynamika fluorescence souvisí s vnitřními fyziologickými vlastnostmi, které se mohou lišit napříč třídami neuronů, ale ne napříč experimenty pro jednu třídu. Tento práh jsme stanovili jako 97,5. percentil pro MDN a dMAN a 90. percentil pro neurony A1. Pro neurony A1 byla zvolena nižší prahová hodnota, protože ve stopách A1 bylo pozorováno mnohem více fluorescenčních přechodů. Tyto tranzienty by byly při použití prahové hodnoty 97,5. percentilu přehlédnuty. Pro identifikaci počátku nárůstu fluorescence jsme našli nejbližší předcházející časový bod, ve kterém derivace překročila nulu. Toto překročení nuly se považuje za časový bod „události“ spojené s identifikovaným zvýšením fluorescence. Události zjištěné blízko sebe bez intervenujícího překročení nuly derivací byly zkomprimovány do jedné události spojené s prvním časovým bodem. Na jedno zvíře bylo provedeno ~10 samostatných pokusů. Události v prvních a posledních 10 s každého experimentu nebyly brány v úvahu, protože okno prezentace dat zahrnovalo 10 s před a 10 s po každé události.
Protože aktivity levého a pravého MDN a dMAN silně kovarují (doplňkový obr. 5), byl pro detekci událostí proveden další krok: pokud byly události detekovány v levém i pravém neuronu do 2 s od sebe, byly zachovány obě události; jinak byla událost identifikovaná pro neuron A (např, MDN vlevo) a nikoliv pro neuron B (např. MDN vpravo), byla rovněž přidána do knihovny událostí neuronu B.
Naproti tomu aktivity levého a pravého A1 nebyly silně kovariační. Proto byly události spojeny s jedním a nikoliv s druhým neuronem. Za tímto účelem, pokud byla detekována událost pro levý i pravý neuron A1 v časovém okně 0,25 s, nebyla ani jedna z událostí použita pro analýzu.
%∆R/R a stopy optického toku spojené s každou událostí byly zarovnány nastavením časových bodů událostí na 0 s. Poté jsme vypočítali průměr a bootstrapované 95% intervaly spolehlivosti pro tyto zarovnané stopy pomocí knihovny Python Seaborn. Měření optického toku a %∆R/R byla pro tuto analýzu převzorkována na 500 hodnot s-1. Pro zvýšení přehlednosti byly stopy %∆R/R odečteny od základní linie, aby byly v době události v souhrnných panelech nulové (obr. 3d, 4d a 5d, e). Kontrolní, promíchané údaje (šedé stopy) byly vypočteny tak, že místo skutečných, identifikovaných událostí byly přiřazeny náhodné časové body. S těmito náhodnými časovými body bylo zacházeno jako se skutečnými událostmi a pro srovnání byly vypočteny a vyneseny jejich průměrné hodnoty a bootstrapované 95% intervaly spolehlivosti.
Analýza rozptylu (doplňkový obr. 5) byla provedena pomocí vlastního skriptu Python, který závisel na knihovnách Matplotlib a Numpy. Byly vypočteny grafy rozptylu pro porovnání hodnot %∆R/R levého a pravého neuronu ze všech experimentů pro každou mouchu zvlášť. Hodnoty Pearsonova r jsou uváděny jako průměr ± směrodatná odchylka.
Chování související s událostmi (doplňkové filmy 8, 10, 12 a 13) bylo ručně vybráno z automaticky detekovaných událostí, jak je popsáno výše. Pro dMAN byly události vybrány z těch, které maximalizovaly rozdíl v předo-zadní rotaci koule mezi 1 s před a 2 s po události. U MDN byly události vybrány z těch, které minimalizovaly předo-zadní rotace koule do 2 s po události. Pro neurony A1 byly události vybrány z těch, které maximalizovaly průměrné rotace míče (pozitivní pro příklady levého neuronu A1 a negativní pro příklady pravého neuronu A1) do 2 s po události.
Na doplňkovém obr. 8 byly odpovědi na blízkou infračervenou laserovou stimulaci zprůměrovány v 10 pokusech pro každé zvíře. Optický tok byl převzorkován na 500 hodnot s-1. Průměrné hodnoty a 95% bootstrapped intervaly spolehlivosti pro stopy optického toku byly změřeny a vykresleny pomocí knihovny Python Seaborn. Knihovna Python Scipy byla použita k provedení Friedmanova a Mannova-Whitneyho U-testu
.