Trojrozměrná rekonstrukce potravního aparátu klíštěte Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): nový pohled na mechanismus krvežíznivosti

Rentgenové zobrazení samice I. ricinus

Ukazujeme, že rentgenové uspořádání CRYTUR (založené na mikrofokusu X-RayWorx, zdroji rentgenového záření a detektoru rentgenového záření CRYCAM) je velmi vhodné pro rychlé a nedestruktivní pozorování vnitřních struktur samic klíštěte impregnovaných osmiem. Obrázek 1A ukazuje chelicerální retrakční svaly zasahující do oblasti druhých párů nohou, tloušťky kutikuly, svaly uvnitř nohou a palpy (obr. 1A, Movie 1). 3D model získaný z 2D rentgenových projekčních snímků poskytl další prostorové informace o povrchových strukturách samičího kapitulu (obr. 1B) srovnatelné s náhledovým zobrazením pomocí SEM (obr. 1D) s výslednou možností zobrazit i některé vnitřní struktury (např. svaly, základy chelicer a hltanu) na různých virtuálních řezech (obr. 1B). Rozlišení rentgenové tomografie bylo 8,060 µm a bylo vypočteno na základě Fourierovy analýzy z rekonstruovaného virtuálního řezu v laterální rovině přítomné uprostřed rekonstruovaného objektu. Sestavili jsme graf radiálně zprůměrovaného výkonového spektra a na základě Rayleighova kritéria hodnotíme oddělení hraničního signálu od šumu na 8,94 % vzdálenosti mezi podlahou šumu a vrcholovou hodnotou. Vzhledem k tomu, že rentgenový model byl rekonstruován z projekčních snímků v rozsahu od 0° do 180° s krokem 10°, je rozlišení technicky téměř izotropní. Toto rozlišení však nebylo dostatečné pro pozorování nymfálních pysků (obr. 1C,D, viz srovnání velikosti samičích i nymfálních pysků při stejném zvětšení).

Sériový řez SEM

Trojrozměrný model potravního aparátu nymfy I. ricinus, který byl rekonstruován ze sériových ultratenkých pryskyřičných řezů, odhalil vztahy salivaria a potravního kanálu ke stylistům kapituly (chelicery, hypostom) a dalším přidruženým strukturám, především svalům (obr. 2, snímky 2 a 3)14.

Zevně z kapitula jsou sliny a krevní moučka vypuzovány/sávány do úzké štěrbiny, preorálního kanálu, vytvořeného mezi rýhou hypostomu na ventrální straně a chelicerami na straně dorzální (obr. 2A). U druhu Rhipicephalus (dříve Boophilus) microplus překrývá hypostomální rýhu tenká blána, nazývaná také žlábek12. Zajímavé je, že tato struktura chybí u Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 a I. ricinus. Uvnitř kapituly pokračují sliny/krev do dutiny salivaria a tato společná cesta končí oddělením potravního kanálu od salivaria (obr. 2A,B). Z hřbetní strany klíštěte se potravní kanál nachází pod saliváriem. Salivárium není trvale fixovaná struktura; vzniká spíše umístěním chelicer nad hřbetní stranou hypostomu. Potravní kanál se odděluje od společné dráhy a ústí do hltanu. Jeho střecha je zpočátku tvořena drobnou lamelou (obr. 2B, zelená šipka), která se v hloubce kapituly zvětšuje v krátkou tyčinku (obr. 2C,I zelená) a pokračuje jako větší sklerotizovaná křídlatá destička (známá také jako alae) (obr. 2E,I, zelená). Všechny tyto struktury dohromady tvoří labrum. Ve spodní části labra se nachází zubovitý výběžek přiléhající k ústí hltanu (obr. 2C,E, černé šipky). Tato zubovitá struktura byla popsána u I. hexagonus, I. holocyclus a Rhipicephalus microplus9,12,16 . Zdá se, že zubovitý výrůstek zapadá do žlábku ústí hltanu, proto se předpokládá, že je důležitou součástí hltanové chlopně. Určení tohoto zubovitého výběžku jako labra je odůvodněno jeho podobností s labrem argasidních klíšťat, které rovněž vystupuje ze střechy hltanu do potravního kanálku13,16. Anatomická stavba potravního kanálku, drobného labra a chlopně u I. ricinus odpovídá pomalému procesu krmení u těchto klíšťat, kdy se během dlouhého období jejich krvežíznivosti střídají dlouhé pulzy sání s pulzy vylučování slin. U měkkých klíšťat se však labrum táhne distálně po celé délce potravního kanálu. To odpovídá rychlému procesu krmení u těchto klíšťat, u nichž je rychlé třepotání labra synchronizováno s rychlým sáním a sliněním, aby se nakrmila během pouhých 1-2 hodin13. Na základě našich EM pozorování nebyla tato přední část hltanové stříšky spojena se svaly a pravděpodobně tvoří stacionární (podpůrnou) část chlopně (obr. 2B). Stříška hltanu je spojena se subhypostomálními deskami, které vytvářejí boky a dno hltanu (obr. 2C bílé šipky). Tyto destičky jsou spojeny s velkými pruhy dilatačních svalů, které jsou na opačných stranách připojeny k ventrální kutikule. Přední dilatační svaly hltanu (ADM, na obr. 2C,E,I jsou zobrazeny jako světle růžově zbarvené struktury) se nacházejí pouze v přední části hltanu a jejich kontrakce/relaxace umožňuje otevírání/zavírání chlopně v hltanovém ústí9,12 . ADM jsou připojeny k hornímu rohu a k hlubokým bočním stranám přední části hltanu. Střední část stěn hltanu je spojena s další skupinou dilatačních svalů, jejichž kontrakce rozšiřuje lumen hltanu do stran. Tyto laterální dilatační svaly hltanu (LDM) jsou vidět na obr. 2G a jako sytě růžově zbarvené struktury na obr. 2I,J. LDM umožňují masivní rozšíření lumen hltanu pravděpodobně také díky dvojité stěně ve tvaru Y v přední části (obr. 2G) a trojité stěně ve tvaru Y v zadní části hltanu v příčném řezu (obr. 2H), které popsali Arthur et al.9 a Sonenshine a Anderson13. Střídání kontrakce a relaxace obou skupin dilatačních svalů rozšiřuje hltan synchronizovaně s otevřením přední chlopně a vytváří silný sací puls. Relaxace LDM po uzavření hltanové chlopně stlačuje hltan a žene spolknutou krev dozadu do jícnu a středního střeva. Časová synchronizace mezi otevřením/zavřením hltanového otvoru, koordinovaná s otevřením a zavřením hltanové chlopně a stlačením/rozšířením lumen ve střední části hltanu umožňuje sání i přesun potravy do jícnu a také zabraňuje regurgitaci krve zpět do hostitele9,12 . Vnitřní výstelka hltanu je sklerotizovaná, zatímco stěna jícnu je vystlána epitelovými buňkami (obr. 2A). Jícen prochází synganglionem a splývá se středním střevem (údaje nejsou uvedeny).

Slinivka je velká dutina nacházející se mezi hltanem a chelicerami (obr. 2A-E). Přední část salivaria je společná pro průchod krve i slin, hltan je pak od dna salivaria oddělen drobnou lamelou (viz výše). Střecha a boční strany salivaria jsou zpevněny sklerotizovanou chelicerální destičkou (ChP na obr. 2C,E,F a červeně zobrazenou strukturou na obr. 2M), která zasahuje dále do dutiny těla klíštěte. V zadní části salivaria jsou boční strany této destičky spojeny se svaly připevněnými na opačných koncích k bočním stranám tělní dutiny klíštěte. Tyto boční svaly salivaria (LMS) jsou na obr. 2E,F,K,L vyznačeny světle fialovou barvou. Kontrakce svalů zplošťuje destičku, která je pevně spojena se stěnou salivaria, což vede k zúžení/uzavření vnitřního prostoru salivaria, avšak pouze v jeho zadní části za oddělením hltanu.

Dále je podlaha zadního konce salivaria spojena s malou skupinou šikmých svalů (svaly připojené k podlaze salivaria, MS na obr. 2E,F,J,N, označené světle modře) připojených v protilehlých částech k horní části přední části hltanu. Tyto svaly umožňují pohyb zadní části dna slinivky nahoru a dolů. Tyto svaly byly popsány u samic I. holocyclus16. Možnost, že podlaha salivária může být snížena nebo zvednuta, byla navržena již dříve v souvislosti s rychlým výronem slin na základě záznamu elektrických signálů během hltání u R. microplus a Dermacentor andersoni12,17,18,19,20 . Během slinění R. microplus byly pozorovány rychlé (až 30 za sekundu) výchylky vodivosti směrem dolů následované většími výkyvy na konci slinění. Jedním z vysvětlení těchto měření jsou kontrakce svalů v přední části hltanu doprovázené podobnou pulzací membrány nad potravním kanálkem (hypostomální žlábek), která otevírá kanál pro vypuzení slin20. Předpokládáme, že malé šikmé svaly připojené ke dnu salivária mohou vytvářet vibrace usnadňující pohyb slin. Na vypuzování slin z ústních otvorů se však mohou podílet i postranní svaly ovlivňující průměr vnitřního prostoru salivária (v animaci nejsou zahrnuty). Předpokládáme, že pohyb chelicer v kůži hostitele může rovněž napomáhat vypuzování slin ze salivária do kůže hostitele. Základy chelicer (ChB na obr. 2A,B) se nacházejí přímo nad saliváriem (z hřbetního pohledu) a předpokládáme, že tyto struktury mohou lokálně stlačovat salivárium a napomáhat tak vypuzování slin. Prodloužení chelicer, které bylo mírně asynchronní, bylo pozorováno pomocí dvoufotonové intravitální mikroskopie přímo v místě žrádla po celou dobu hltání I. scapularis21. Všimli jsme si, že chelicery se začaly pohybovat mírně asynchronně po aplikaci pilokarpinu na hřbetní kutikulu nenakrmených a částečně nakrmených samic I. ricinus (snímky 5 a 6). Základy chelicer (ChB na obr. 2A,B) se nacházejí přímo nad saliváriem (z hřbetního pohledu) a můžeme spekulovat, že tyto struktury mohou rozšiřovat nebo stlačovat salivárium a pomáhat vylučovat sliny. Je známo, že aplikace pilokarpinu, cholinergního neendogenního léčiva, vyvolává slinění nepřímo prostřednictvím centrální nervové soustavy klíštěte22 , zatímco jeho účinek na ostatní tkáně klíštěte zůstává nejasný. Proto nelze vyloučit pilokarpinem zprostředkovaný pohyb chelicer v našich experimentech jako další účinek tohoto léčiva u klíšťat. Bockenstedt a kol. předpokládali, že chelicery vytlačují zpět kolagenní vlákna, která mohou stlačovat místo krmení, což značně potvrzuje naše hypotézy o chelicerami zprostředkovaném vypuzování slin do hostitele21.

Těsně před koncem slinné dutiny vstupují do jejích bočních rohů párové slinné kanálky12. Oba slinné kanálky jsou uzavřeny v plátu tkáně (TSD na obr. 2C,E,F,M,N, tmavě fialový), který pravděpodobně pružně upevňuje slinné kanálky k bočním rohům salivaria.

Simulace slinění a sání krve na základě 3D modelu

Během procesu krmení se u ixodidních klíšťat střídá slinění buď s pomalým, nebo rychlým sáním krve a může zahrnovat i období klidu. Procentuální podíl času stráveného jednotlivými činnostmi během přisátí samice je různý a závisí na denní době, velikosti klíštěte atd.18 . Ve filmu 4 jsme oživili jak potravní kanál, tak kanál pro průchod slin s přidruženými strukturami a ukázali, jak tyto struktury fungují. Proces přikrmování většiny ixodidních klíšťat začíná vylučováním látek podobných cementu, které umožňují klíštěti fixovat se v kůži hostitele a utěsňují mezeru mezi přikrmovací lézí a vsazenými ústními orgány23,24,25 . Období slinění může být ukončeno krátkým výronem slin16,17,18,19. Vypuzování slin je pravděpodobně usnadněno vibracemi zadní části dna salivária; ve hře může být i pohyb základen chelicer (film 6). Před zahájením sání krve je otvor zadní části salivária zúžen postranními svaly napnutými mezi střechou salivária a boční stěnou těla klíštěte. Po této akci následuje otevření hltanové chlopně a rozšíření přední části hltanu způsobené kontrakcí předních dilatačních svalů. Následně se střední část hltanu roztáhne podél své podélné osy a krev je nasávána do hltanu. Přední hltanová chlopeň se uzavře, než se stěna hltanu opět stáhne a krev je vytlačena dozadu do jícnu. Tato peristaltická vlna se opakuje, dokud nezačne slinění. Na začátku slinění se uvolní postranní restrikční svaly slinivky, čímž se zvětší dutina slinivky. Opakované spouštění a zvedání střechy salivária v jeho zadní části pravděpodobně usnadňuje dodávání slin do předsíňového kanálu.

.