Přidání tetramizolu (Sigma T1512, zásobní roztok 10 mg/ml v H2O zředěný na přibližně 100 μg/ml ve vaječných solích) není povinné; toto léčivo paralyzuje červy a usnadňuje řezání. Řežte okamžitě: pokud by došlo k přílišné kontrakci, červi by neuvolnili mnoho vajíček. Každý den používejte nové ostří skalpelu, protože rychle koroduje. Přebytek tetramisolu způsobí, že se v roztoku NaOCl vytvoří sraženina.
Pro maximální výtěžnost lze uvolnit více vajíček ošetřením naříznutých červů po dobu přibližně 1 minuty stejným objemem roztoku NaOCl přidaným přímo do kapky řezu. Jakmile se vajíčka uvolní, přidejte stejný objem EGM jako použitého NaOCl, abyste zabránili dalšímu poškození vajíček. Toto ošetření usmrtí pronukleární stádia a poškodí jednobuněčná embrya. Před ošetřením chitinázou je ještě nutné provést 3minutové ošetření NaOCl, aby došlo k rovnoměrnému rozkladu. U vajíček v ranějším než dvoubuněčném stadiu, u nichž je skořápka ještě do jisté míry propustná, přidejte stejný objem EGM, jakmile jsou červi rozříznuti. Poté může mnoho z nich přežít 3minutové ošetření NaOCl a chitinázou a někteří budou po ošetření chitinázou a odstranění vitellinového obalu stále v jednobuněčném stadiu, pokud budete pracovat rychle.
Uspokojivé přenosové pipety se vyrábějí z mikropipet SMI o objemu 5 až 30 μl (Fisher 21-380-9C) nebo ze 4palcových kapilár World Precision Instruments (1B100F-4) dvojitým tahem nad velmi malým plamenem. To se provádí tak, že se kapilára nejprve zahřeje a jemně vytáhne, aby se vytvořil tenký středový řez, poté se krátce ochladí a poté se znovu jemně zahřeje, přičemž se kapilára udržuje v tahu pro závěrečné vytažení. Ideálním tahem vznikne pipeta se zřetelným dříkem a úzkým postupně se zužujícím průřezem o velikosti asi 3/4-1 palec. Malý plynový hořák lze vyrobit upevněním velké injekční jehly do korku se šroubovací svorkou na hadičce pro regulaci průtoku plynu. Alternativně lze pipety shodné velikosti vyrobit tažením na automatickém stahováku. Před použitím rozlomte kapiláru na požadovanou špičku, asi 100-150 μm (trojnásobek nebo čtyřnásobek průměru vajíčka), sevřením mezi nehtem a špičkou prstu nebo pomocí žiletky pod pitevním mikroskopem. Mikroskop Microforge může pomoci při vytváření konzistentních pipet, i když není nezbytný. Průměr pipety musí být malý, aby se minimalizoval přenos kapaliny. Pokud se vajíčka přilepí na vnitřní stranu pipety, lze jich mnoho získat zpět propláchnutím roztokem NaOCl nebo EGM za chodu. Počítejte s tím, že budete pipety často měnit, a před pracovním sezením si vytáhněte dobrou zásobu.
Pokud rozklad chitinázy neproběhne do 8 minut, pravděpodobně nebude fungovat vůbec. Nejčastějšími problémy jsou chlornan nebo fyziologický stav červů (zdá se, že první den kladení dává tužší vajíčka). Hypochlorit by měl být neprošlou šarží a obvykle se stává špatným asi měsíc před datem spotřeby. Zásobu uchovávejte v chladu v tmavé lahvi s ventilací, naplněné téměř po okraj. Těsně před začátkem promíchejte zkumavku o objemu 3 ml a uchovávejte ji na ledu; bude fungovat asi 3 h a pak by se měla vyměnit.
Po ošetření enzymy a zejména po permeabilizaci jsou embrya poměrně lepkavá a shlukují se; to lze minimalizovat pipetováním po jednom nebo jen po několika. Malé shluky lze rozbít tak, že se z pipety několikrát vypudí malou silou.
Permeabilizační pipety se vytahují ručně stejným způsobem jako přenosové pipety pomocí injekčních kapilár Kwik-fil (1B100F-4 od společnosti World Precision Instruments). Vnitřní vlákno může napomoci přetnutí sklivcového obalu. Ideálním tahem získáte dlouhý postupný kužel v tenkém řezu, takže jej lze rozříznout na požadovaný průměr. Pipety se řežou čerstvou čepelí skalpelu na Parafilmu pod pitevním dalekohledem. Adaptér pro ústní pipetu lze vyrobit pomocí maloprůměrové trubičky Tygon navlečené na jehlu injekční stříkačky připojené k ústní trubičce. Naplňte špičku pipety EGM zpět do širšího otvoru a vyzkoušejte na první várce chitinovaných embryí; pokud je špička pipety příliš malá, znovu ji zkraťte. Ideální velikost se liší podle stáří embrya, které se snažíte získat; velmi raná stádia jsou křehčí a potřebují o něco větší otvor; embrya větší než osm buněk se stlačí s menším poškozením a často vyjdou z větších pipet s neporušeným sklivcovým obalem. Takto nepermeabilizovaná embrya budou pokračovat ve vývoji až do stadia líhnutí.
Pro plnění a čištění permeabilizačních pipet používejte stříkačku na ústní pipetě; vlastní permeabilizace se provádí tlakem vzduchu v ústech. Pipety mohou být na vzduchu několik hodin, aniž by vyschly, protože otvor je tak malý, ale jak vysychají, nakonec se ucpou. Pipety skladujte (dobré se vyplatí hlídat a vydrží několik týdnů) tak, že několikrát propláchnete špičku destilovanou vodou a zavěsíte špičku pipety do zkumavky se sterilní destilovanou vodou nebo 0,1 M HCl, přičemž na pipetě použijte „praporek“ z pásky, aby se úplně nepotopila.
Pokud je pipeta správná, trvá permeabilizace dávky embryí jen několik minut tím, že je jednotlivě nasajete do pipety a jemně vypudíte. V závislosti na vnitřním průměru pipety se vynoří více nebo méně stlačená, ale během několika minut se opět zakulatí. Pokud při permeabilizaci dojde k velké lýze, buď bylo trávení neúplné, nebo byl otvor pipety příliš malý. Vzhledem k tomu, že buněčné membrány jsou po dobu 4-5 minut po zahájení cytokineze poměrně labilní, mohou embrya devitalizovaná během štěpení a těsně po něm lyzovat nebo mohou blastomery splynout a později projít abnormálním tetrapolárním štěpením. Pokud je to kritické, zkontrolujte to během experimentu a taková embrya vylučte.
Nejvhodnějším nástrojem pro rychlé manuální oddělení blastomer je velmi jemná řasa (tradiční nástroj pro elektronovou mikroskopii) připevněná na párátku s lepidlem; skleněná jehla také funguje, ale snadno se zlomí. Řasy lze očistit alkoholem a kapesníkem. Blastomery lyzují, pokud jsou odděleny těsně po dělení; 5-10 minut po štěpení je nejlepší čas pro úspěšnou manipulaci, pokud nepotřebujete dřívější oddělení. Nejjednodušší jsou separace AB/P1. Lze také oddělit čtyřbuněčná embrya. Alternativně lze pro získání blastomer P2 a EMS oddělit P1 po prvním dělení a EMS/P2 po druhém dělení. Blastomery linie P lze rozpoznat podle relativní velikosti a jejich lineárního uspořádání. Při nízké výtěžnosti lze ze čtyř potomků počáteční izolované blastomery P1 oddělit MS, E, P3 a C. Identifikace buněk provedená na základě jejich velikosti může být potvrzena zkoumáním odlišných období buněčného cyklu
.