Následující schéma vysvětluje, jak funguje tandemová MS. Jakmile jsou vzorky ionizovány (pomocí ESI, MALDI, EI atd.) za vzniku směsi iontů, jsou vybrány prekurzorové ionty s určitým poměrem hmotnosti a náboje (m/z) (MS1) a poté fragmentovány (MS2) za vzniku produktových iontů pro detekci. Sekvenci výběr-fragmentace-detekce lze dále rozšířit na produktové ionty první generace. Například vybrané produktové ionty generované v MS2 mohou být dále fragmentovány za vzniku další skupiny produktových iontů (MS3) a tak dále.
*http://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_mass_spectrometry
Tandemová MS instrumentace
Protože tandemová MS zahrnuje tři různé kroky selekce-fragmentace-detekce, může být oddělení těchto tří kroků realizováno v prostoru nebo v čase.
Tandemová MS v prostoru
Typické přístroje pro tandemovou MS v prostoru zahrnují QqQ, QTOF a hybridní iontovou past/FTMS atd.
QqQ (trojitý kvadrupól)
* http://www.biologie.hu-berlin.de/gruppenseiten/oekologie/meth/massspec/mass_sp
Tři kvadrupóly (Quad 1, Quad 2 a Quad 3) jsou seřazeny za sebou. Prekurzorové ionty jsou vybrány v Quad 1 a odeslány do Quad 2 k disociaci (fragmentaci). Vzniklé produktové ionty jsou odeslány do Quad 3 pro hmotnostní skenování.
QTOF (Quadrupole Time-of-flight)
* http://www.ucl.ac.uk/ich/services/lab-services/mass_spectrometry/proteomics/technologies/madli
V QTOF jsou prekurzorové ionty vybrány v Quadrupolu a odeslány do kolizní buňky k fragmentaci. Vzniklé produktové ionty jsou detekovány hmotnostní spektrometrií doby letu (TOF).
Hybridní iontová past/FTMS
*http://planetorbitrap.com/orbitrap-velos-pro#tab:schematic
U přístrojů s hybridní iontovou pastí/FTMS (FT-ICR nebo Orbitrap) jsou prekurzorové ionty vybrány a fragmentovány ve vnější iontové pasti. Vzniklé produktové ionty lze detekovat buď ve vnější pasti (nižší hmotnostní rozlišení, ale rychlejší), nebo pomocí FTMS (vyšší hmotnostní přesnost a rozlišení, ale pomalejší).
Tandem-in-Time MS/MS
Typické přístroje Tandem-in-Time MS/MS zahrnují iontovou past a FT-ICR MS.
Zápis fragmentových iontů
Peptidy a oligosacharidy (včetně glykolipidů) se řídí různými systémy názvosloví pro své fragmentové ionty. Ostatní třídy sloučenin, tj. fosfolipidy atd, nemají dosud zavedené nomenklaturní systémy.
Peptidy
Nomenklatura peptidových fragmentů
Fragmenty obsahující N-konec se označují a, b nebo c, v závislosti na místě štěpení, zatímco fragmenty obsahující C-konec se označují x, y nebo z. Čísla označují počet aminokyselinových zbytků v iontu fragmentu.
Oligosacharidy (včetně glykolipidů)
U oligosacharidů jsou fragmenty obsahující redukující konec (redukující konec je na obrázku na pravé straně) označeny x, y nebo z v závislosti na místě štěpení, zatímco fragmenty obsahující druhý konec jsou označeny a, b nebo c. Čísla označují místo, kde se nachází cukerný zbytek: ionty y, z, b a c jsou fragmenty způsobené glykosidickým štěpením (přerušení glykosidických vazeb držících dva sousední cukerné zbytky), zatímco ionty a a x jsou výsledkem štěpení příčného kruhu.
Nomenklatura pro oligosacharidové fragmenty (včetně glykolipidů, kdy R = ceramid) (Costello, C. E.; Vath, J. E. Methods Enzymol. 1990, 193, 738-768)
Fragmentační techniky
Prekurzorové ionty mohou být aktivovány (se zvýšenou vnitřní energií) mnoha různými způsoby. Způsoby fragmentace závisí na způsobu přenosu energie na prekurzorový iont, na množství přenesené energie a na způsobu vnitřního rozložení přenesené energie. Srážkou indukovaná disociace a infračervená multifotonová disociace jsou techniky „pomalého zahřívání“, které zvyšují Boltzmannovu teplotu iontu a přednostně tak štěpí nejslabší vazby za vzniku převážně b a y iontů. Tyto techniky jsou poměrně účinné pro peptidy, lipidy a další relativně malé chemické sloučeniny, ale mohou také odstranit posttranslační modifikace proteinů (např. fosfáty a cukry). Disociace s elektronovým záchytem a disociace s přenosem elektronů produkují hlavně ionty c a z, přičemž zachovávají posttranslační modifikace (PTM). ECD a ETD se proto široce používají u proteinů a peptidů s labilními PTM. U oligosacharidů (včetně glykolipidů) mohou ECD/ETD rovněž generovat ionty a a z odštěpené zkříženým kruhem, které jsou klíčové pro lokalizaci glykosidických vazeb.
Tuto techniku lze použít s následujícími přístroji:
- 21 Tesla FT-ICR MS (aktivně stíněná)
- 14,5 Tesla FT-ICR MS (aktivně stíněná)
- 9,4 Tesla FT-ICR MS (pasivně stíněná)
Související publikace
B. J. Bythell, et al, Relative stability of peptide sequence ions generated by tandem mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 23(4), 644-654 (2012) Read online
Pro více informací kontaktujte Amy McKenna, Manager, ICR User Program.
.