7 Vazba RAG v celém genomu
Vzhledem k přímým vazebným vlastnostem RAG1 na DNA v kombinaci s jedinečným množstvím RSS přítomných v genech antigenních receptorů bylo rozumné předpokládat, že specifičnost místa V(D)J rekombinace je jednoduše vynucena preferenčním náborem RAG1 na jeho preferované substráty DNA. RAG2 by vzhledem ke svému PHD a nedostatku vlastní katalytické aktivity neměl vykazovat žádná funkční omezení svých lokalizačních vzorců. V souladu s tím se RAG2 váže široce napříč genomem lymfocytů a obsazuje hlavní část (~ 60 %) aktivních TSS, které jsou obohaceny o H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). RAG1 se však také lokalizuje na tisících míst (~ 3500 u myších thymocytů a pre-B buněk), která jsou společně obsazena RAG2 a H3K4me3, což zahrnuje podstatnou část vysoce aktivních, liniově specifických promotorů a enhancerů (Teng et al., 2015). Tato rozsáhlá lokalizace je pozorována také u katalytické mutanty RAG1 (D708A), což naznačuje, že rozsáhlá vazba RAG1 neodráží postklíčovou akumulaci (Teng et al., 2015). Vazby RAG1 mimo geny antigenních receptorů nevykazovaly jasnou korelaci s přítomností motivů podobných RSS (kryptické RSS neboli cRSS), což dále naznačuje, že sekvenčně specifické kontakty a štěpná aktivita RAG nemohou vysvětlit vzorce vazby RAG1 v celém genomu. Místo toho jsou markery přístupnosti chromatinu nejlepšími prediktory náboru RAG1: H3K4me3, H3K27Ac, zvýšený obsah GC a zvýšený obsah CpG (Teng et al., 2015).
Ve skutečnosti pouze několik příkladů prokazuje specifický nábor RAG1 do genů antigenních receptorů prostřednictvím transfaktorů, které interagují jak s RAG1, tak se specifickými motivy DNA. V každém případě lokusová specifita náboru nezávisí na RSS jako takovém, ale na vazebném motivu transkripčního faktoru, který se náhodně překrývá s RSS. Myší lokus Tcrb ilustruje případ, kdy cílený nábor RAG1 přispívá k omezením „za 12/23“, která pomáhají udržovat správné pořadí rekombinace (Dβ-Jβ před Vβ-DJβ). 3′ 23-RSS lemující Dβ1 a Dβ2 obsahují konzervovaná vazebná místa pro c-fos, podjednotku transkripčního faktoru AP-1 (Wang et al., 2008). Způsobem, který je nezávislý na jeho transkripčních aktivačních vlastnostech, c-fos přednostně rekrutuje RAG1 do 3′ Dβ RSS, čímž podporuje rekombinaci Dβ-Jβ (Wang et al., 2008). V linii B je analogickým antigenním receptorovým lokusem gen Igh, kde je přímá rekombinace Vh-Dh znevýhodněna oproti rekombinaci Vh-DJh. V tomto případě se však zdá, že pořadí rekombinace je regulováno lokálními posuny epigenetických značek, které následují po rekombinaci D-Jh a označují produkt DJ pro přednostní vazbu RAG1 a rekombinaci oproti zárodečným segmentům genu Dh (Subrahmanyam et al., 2012). Kromě toho je přímá rekombinace Vh-Dh potlačena sekvenčním prvkem známým jako IGCR1, který leží mezi klastry genů D a V (Guo et al., 2011). IGCR1 obsahuje dvě důležitá místa CTCF a předpokládá se, že funguje jako kotevní bod pro chromatinové smyčky, které oddělují DJ část lokusu Igh od V části (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). Lidský lokus Tcrd poskytuje další příklad lokusově specifického ukládání RAG1, kde Runx1-dependentní nábor RAG1 na Dδ2 upřednostňuje událost přeskupení Dδ2-Dδ3, která předchází klasické rekombinaci Dδ-Jδ (Cieslak et al., 2014). To má za následek pro člověka specifické začlenění dvou segmentů genu D do přestavby Tcrd. A konečně se předpokládá, že Pax5 interaguje s RAG a usnadňuje nábor RAG do segmentů genu Vh (Zhang et al., 2006), i když zatím nebylo prokázáno, že tento mechanismus zvyšuje endogenní sestavení lokusu Igh.
Mimo tyto výjimky se nezdá, že by vazba RAG1 byla iniciována primárně ze sekvenčně specifických náborových událostí. Dokonce i v rámci genů Tcr a Ig se vazba RAG1 rozšiřuje za hranice RSS a obsazuje intronické oblasti, které jsou obohaceny o H3K4me3, ale postrádají RSS (Teng et al., 2015). To neznamená, že RSS nehrají sekundární roli při stabilizaci nebo posilování vazby RAG1 po náboru. Geny Tcra a Igk jsou hlavními rekruty vazby RAG1 u dvojitě pozitivních thymocytů, respektive pre-B buněk, a nad RSS jsou jasně pozorovány definované vrcholy akumulace RAG1 v rekombinačních centrech (Teng et al., 2015). Výjimečná hustota RSS v genech antigenních receptorů je pravděpodobně jedním z důležitějších znaků, které je odlišují od zbytku genomu.
Genom obecně však vykazuje nábor RAG1 nezávislý na RSS, k němuž pravděpodobně dochází prostřednictvím nespecifických interakcí mezi RAG1 a DNA, které jsou zprostředkovány různými doménami v jádře RAG1, včetně NBD (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Kromě toho může docházet k nepřímému náboru RAG1 na chromatin prostřednictvím jeho interakce s RAG2, ačkoli ta nemůže plně vysvětlit vazebné vzorce RAG1, které jsou částečně zachovány v nepřítomnosti RAG2, i když se sníženou intenzitou (Teng et al., 2015).
Genomový rozsah vazebných míst RAG1, ačkoli je širší, než se předpokládalo, se ještě více rozšiřuje v nepřítomnosti nejádrových domén RAG1 nebo RAG2. Při absenci C-koncové oblasti RAG2 (která zahrnuje PHD) se RAG1 šíří směrem k místům s nižší hustotou H3K4me3, místo aby se naváděl k nejaktivnějším TSS (Teng et al., 2015). Jednou z možností je, že je to důsledek demaskování dalších nespecifických DNA vazebných aktivit RAG1 vzhledem k absenci autoinhibiční domény, která se nachází v C-koncové oblasti RAG2 (Lu et al., 2015). Další možností je, že při absenci PHD domény RAG2 má komplex RAG menší sklon k domovským oblastem s vysokým H3K4me3. Pro širší vzorec vazby RAG1 může mít význam také skutečnost, že delece C-koncové oblasti RAG2 vede ke zvýšení hladiny proteinu RAG1 (Teng et al., 2015). Jádro RAG1 se také váže mnohem promiskuitněji než RAG1 plné délky a je zajímavé, že vykazuje zvýšenou intenzitu vazby na mnoha místech, která nejsou antigenními receptory, ale sníženou intenzitu v lokusu Tcra, ve srovnání s RAG1 plné délky(Teng et al., 2015). To může odrážet změny ve vnitřních vazebných vlastnostech DNA zkráceného proteinu RAG1 nebo absenci aktivit kódovaných v nejádrových zakončeních RAG1 (jako je RING-zprostředkovaná ubikvitilace histonů nebo C-koncem zprostředkovaná autoinhibice). Důležitá může být také výše uvedená skutečnost, že jádro RAG1 je exprimováno v podstatně vyšších hladinách než RAG1 plné délky.
Rekombináza RAG toleruje sekvenční odchylky nejen ve svých substrátech, zejména v RSS spaceru, ale také v heptameru a nonameru (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Dokonce i interakce mezi RAG1 a neamerem zprostředkovaná NBD se opírá o relativně málo sekvenčně specifických kontaktů (Yin et al., 2009). RSS, které osídlují geny antigenních receptorů, se liší svým sekvenčním obsahem (někdy se výrazně liší od konsensuálních heptamerových a neamerových motivů) a rozpoznávání substrátu pomocí RAG musí být dostatečně flexibilní, aby umožnilo maximální rozmanitost repertoáru. Mimo geny antigenních receptorů nevykazují vazebná místa RAG1 kumulativní preferenci žádného konkrétního sekvenčního podpisu (Teng et al., 2015).
Pružné rozpoznávání substrátu RAG však vytváří problém pro zbytek genomu. Poměrně minimální sekvenční požadavky na funkční RSS (alespoň podle pravidel, kterým v současnosti rozumíme) umožňují, aby se cRSS vyskytovaly v genomech obratlovců poměrně často (Lewis et al., 1997). Nebezpečí náhodných cRSS je zřejmé z jejich účasti na genetických přestavbách závislých na RAG, které přispívají k lymfomagenezi (Larmonie et al., 2013). Vzhledem k tomu, že většina vazeb RAG1 v celém genomu je řízena nespecifickým náborem do DNA nebo přístupného chromatinu, zdálo by se biologicky rozumné omezit dostupnost silných cRSS v blízkosti vazebných míst RAG1 a minimalizovat tak potenciál pro off-target aktivitu RAG. Vazebná místa RAG1 v myších a lidských lymfocytech jsou skutečně přednostně ochuzena o cRSS (Teng et al., 2015) a my se domníváme, že k tomu došlo v důsledku selekčních tlaků vyvolaných genetickými přestavbami probíhajícími mimo geny antigenních receptorů. Repertoár TSS asociovaných s RAG1 je tedy chráněn před aktivitou RAG během V(D)J rekombinace. Předpokládáme, že vzácné cRSS, které si zachovávají aktivitu a nadále zprostředkovávají málo časté ektopické přestavby, byly v genomu zachovány díky tomu, že se překrývají s regulačními nebo funkčními sekvencemi v jejich hostitelských lokusech, nebo prostě nevyvolaly dostatečně silné negativní důsledky, aby byly selektovány.