I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Enzymatická reakce (obrázek se otevře v novém okně)
Pankreatická ribonukleáza (RNáza) je endoribonukleáza. Katalyzuje štěpení fosfodiesterové vazby mezi 5′-ribozou nukleotidu a fosfátovou skupinou připojenou k 3′-riboze sousedního pyrimidinového nukleotidu. Tímto štěpením vzniká 2′,3′-cyklický fosfát, který je poté hydrolyzován na odpovídající 3′-nukleosidfosfát.
RNasa se v největším množství nachází v pankrease přežvýkavců (Barnard 1969). Hlavní složkou krystalického enzymu je RNáza A; vedlejší složkou je RNáza B. RNáza B je glykosylovaná forma RNázy A (Beintema et al. 1976).
Historie:
Jonesova práce z roku 1920 se obvykle uvádí jako „počátek“ pankreatické ribonukleázy (Richards a Wycoff 1971). RNázu izolovali Dubos a Thompson v roce 1938 a v roce 1940 ji krystalizoval Kunitz.
V roce 1947 byla Worthingtonova společnost první, která vyrobila vysoce purifikovanou krystalickou RNázu. Na počátku 50. let 20. století připravila společnost Armour surový krystalický enzym a nabízela jej za velmi přijatelnou cenu. V průběhu 60. a 70. let byla RNáza A oblíbená ke studiu především proto, že je pozoruhodně termostabilní a vyskytuje se ve vysoké koncentraci v dostupném zdroji, hovězí slinivce břišní. Tyto studie vedly k objasnění krystalové struktury (Anfinsen 1959, Groves 1966 a Scheraga 1967), určení sekvence aminokyselin (Smyth et al. 1963), identifikaci katalytického mechanismu (Beers 1960) a objasnění způsobu skládání (Hantgan et al. 1974). RNáza A byla prvním enzymem a třetím proteinem, u kterého byla určena správná aminokyselinová sekvence (Raines 1998).
Čtyři Nobelovy ceny byly uděleny za práce spojené se studiem RNázy (Anfinsen, Moore, Stein a Merrifield). Díky rozsáhlé literatuře a četným studiím se RNáza stala nejrozsáhleji studovaným enzymem 20. století (Raines 1998).
Nejnovější práce pokračují ve zkoumání syntézy a zrání RNázy v endoplazmatickém retikulu živých buněk (Geiger et al. 2010). Mnoho práce se také stále věnuje studiu skládání a agregace RNázy (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008 a Arai et al. 2010). Studuje se role enzymu ve vývoji rakoviny a genové regulaci (Shlyakhovenko 2009) a pracuje se na vývoji chemoterapeutických látek pro léčbu rakoviny (Chao et al. 2010).
Specifičnost:
RNasa A je specifická pro pyrimidinové nukleosidové vazby (Volkin a Cohn 1953). Předpokládá se, že reakce probíhá ve dvou krocích. V prvním kroku se štěpí 3′,5′-fosfodiesterová vazba, přičemž vzniká 2′,3′-cyklický fosfodiesterový meziprodukt. Ve druhém kroku je cyklický fosfodiester hydrolyzován na 3′-monofosfátovou skupinu. První krok je nespecifický s ohledem na dusíkatou bázi substrátu; druhý krok je však zcela specifický pro pyrimidinové nukleotidy s koncovými 2′,3′-cyklickými fosfáty. RNáza B má stejnou specifitu jako RNáza A vůči cyklickému cytidylátu i kvasinkové RNA (Plummer a Hirs 1963). RNáza A vykazuje preferenci větších substrátů (Nogués et al. 1995).
Enzym štěpí na cytidinových zbytcích dvakrát rychleji než na uridylových (Richards a Wyckoff 1971). Bylo zjištěno, že Thr45 je nejdůležitější pro zprostředkování pyrimidinové specifity, a to jak tvorbou vodíkových vazeb s pyrimidinovými bázemi, tak sterickým vyloučením purinových bází (del Cardayré a Raines 1994). Postranní řetězec Asp83 je důležitý pro stabilizaci přechodného stavu při štěpení substrátů obsahujících uridin; tento zbytek nemá žádný vliv na kinetiku štěpení cytidinu (del Cardayré a Raines 1995).
Složení:
Tvar proteinu připomíná ledvinu, přičemž zbytky aktivního místa leží v rozštěpu (Richardson 1981 a Raines 1998). Sekundární struktura obsahuje dlouhé čtyřřetězcové antiparalelní beta-listy a tři krátké alfa-helixy (Raines 1998). RNáza A obsahuje čtyři disulfidické vazby, které jsou rozhodující pro stabilitu nativního enzymu. Dvě z těchto disulfidických vazeb leží mezi alfa-helixem a beta-listem a přispívají k tepelné stabilitě více než zbylé dvě (Klink et al. 2000). RNáza B je glykoprotein obsahující na Asn34 jediný oligosacharid složený ze šesti zbytků manózy a dvou zbytků N-acetylglukosaminu (Tarentino et al. 1970).
Molekulární charakteristika:
RNáza A je malý protein, zralý enzym má pouze 124 aminokyselinových zbytků bez připojeného sacharidu. RNáza A obsahuje 19 z 20 aminokyselin, chybí pouze tryptofan (Nogués et al. 1995 a Raines 1998). Trojrozměrná struktura RNázy A je plně zakódována její aminokyselinovou sekvencí (White a Anfinsen 1959 a Raines 1998). Všech osm lidských genů podobných RNáze A se nachází na 14. chromozomu. Každý z nich kóduje sekreční signální sekvenci a obsahuje invariantní katalytickou triádu dvou histidinů a jednoho lysinu s konzervovaným motivem (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Aminokyselinové sekvence mnoha homologů RNázy A byly identifikovány, což z RNázy A činí modelový systém pro molekulární evoluci obratlovců (Dyer a Rosenberg 2006). Ze sekvencí a jejich rozložení u řady druhů bylo zjištěno, že RNáza A je moderní protein, který se rychle vyvíjí (Doolittle 1992 a Raines 1998).
Proteinové přístupové číslo: P61823
Klasifikace CATH (v.3.2.0):
- Třída: RNAS: Alfa-Beta
- Architektura:
- Topologie: P-30 Protein
Molekulová hmotnost:
- RNasa A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNasa B: 14,700 ± 0,3 (Plummer a Hirs 1963)
Optimální pH: RNáza A: 7,0-7,5 (Brown a Todd 1955)
Isoelektrický bod:
- RNáza A: 9,3 (Ui 1971)
Koeficient extinkce:
- RNáza A a B: 8,640 cm-1M-1 (teoretický)
- RNáza A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthingtonova RNáza A)
- RNáza B: E 1%, 280 = 5.77 (teoretická, RNáza B)
Zbytky aktivního místa:
- Histidin (H12, H119)
- Lyzin (K41)
Aktivátory:
- Chlorid sodný (Weickmann et al. 1981)
- Sulfát (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitory:
- Ionty těžkých kovů
- Inhibitor ribonukleázy (RI), protein o velikosti 50 kDa, který tvoří ≤ 0,5 % z celkové hmotnosti.01 % bílkovin v cytosolu savčích buněk (Takahashi 1967)
- Uridin-vanadátové komplexy (Lindquist et al. 1973)
Použití:
- Odstranění RNA při izolaci DNA
- Analýza sekvence RNA
- Testy ochrany proti RNase
- Kvantifikace nebo mapování RNA
- Odstranění plazmidové DNA
- Izolace genomové DNA
- Molekulární hmotnostní marker
.