Nekrotrofní způsob života Rhizoctonia solani AG3-PT při interakci s hostitelskou rostlinou bramborem odhalený analýzou transkriptomu

Analýza transkriptomu

Mezidruhová interakce mezi R. solani AG3-PT izolátu Ben3 se středně odolnou odrůdou bramboru ‚Arkula‘ byla analyzována na úrovni transkriptomu pomocí sekvenování RNA. Za účelem zjištění faktorů důležitých pro vznik interakce a další průběh interakce jsme použili tři různé vzorky: čisté mycelium izolátu R. solani AG3-PT Ben3 kultivované bez přitahování rostoucí rostlinou bramboru (Ben3); klíčky bramboru ve 3 dpi hlíz s R. solani (časné) a 8 dpi (pozdní). V obou termínech odběru vzorků R. solani v interakci s klíčky brambor byly všechny vzcházející klíčky sklizeny a použity v analýze. Nekrotické léze na klíčcích se poprvé projevily v 8 dpi. Následně byla provedena extrakce RNA, sekvenování RNA (RNAseq) a mapování čtení do genomu izolátu Ben334 pro výpočet hodnot čtení na kilobázi na milion mapovaných čtení (RPKM). Obecně bylo u inokulovaných vzorků na návrh genomu Ben3 mapováno 1 až 23 % každého souboru dat. U kontrolních vzorků bylo možné na genom Ben3 namapovat 70 až 75 % těchto datových souborů.

Ve všech třech vzorcích bylo možné zjistit srovnatelný počet genů, které byly exprimovány (tabulka 1). V čistém myceliu bylo exprimováno 11 206 genů z identifikovaných 12 567 genů na genomu Ben3 izolátu R. solani AG3-PT, zatímco čtení bylo možné mapovat na 10 181 a 9 939 genů při 3 dpi a 8 dpi. Souhrnně lze říci, že ve všech transkriptomech v rámci tohoto experimentu bylo v některém z analyzovaných vzorků exprimováno 11 287 genů z identifikovaných 12 567 genů na genomu R. solani AG3-PT izolátu Ben3.

Jak je zřejmé z tabulky 1, množství celkových mapovaných čtení se značně lišilo. To je dáno tím, že při vzorkování Ben3 byl sekvenován transkriptom čistého mycelia izolátu R. solani AG3-PT Ben3, zatímco při časném a pozdním vzorkování (3 a 8 dpi) byl použit duální přístup RNAseq, který umožňuje přístup k transkriptomům obou interagujících organismů současně30. Vzhledem k tomu, že velikosti knihoven a množství sekvencí získaných z každé knihovny byly srovnatelné, bylo možné při vzorkování Ben3 téměř všechna čtení mapovat na genom izolátu Ben3. V duálních přístupech RNAseq při vzorkování na 3 a 8 dpi bylo možné mapovat pouze část produkovaných čtení na genom Ben3, zatímco ostatní se mapovala převážně na genom bramboru. Vzhledem k těmto rozdílným množstvím celkových mapovaných čtení do genomu Ben3 izolátu R. solani AG3-PT na jeden odběr je třeba vzít v úvahu následující skutečnosti: (1) geny s nízkou hodnotou RPKM pouze v Ben3 nemusí být nutně neexprimovány, když houba napadne rostlinu, může to být způsobeno pouze velikostí knihovny; (2) geny, které jsou exprimovány ve všech třech odběrech, lze přiřadit k běžně exprimovaným; (3) geny, které jsou exprimovány pouze v mnohem menších knihovnách 3 a 8 dpi odběrů, lze považovat za interakčně specifické.

Souhrnné výsledky mapování (tabulka 1) již naznačily, že musí existovat mnoho genů společně exprimovaných ve všech třech vzorkováních. Proto byl sestrojen Vennův diagram pro porovnání těchto tří vzorkování a vizualizaci vypočteného počtu genů, které mají společné, oproti počtu genů, které jednotlivé vzorkování odlišují (obr. 1). Bylo zjištěno, že více než 9 000 genů je exprimováno ve všech třech vzorcích, zatímco 871 genů je přepisováno výhradně v myceliu bez kontaktu s rostlinami. Ve vzorcích 3 a 8 dpi byla zjištěna společná exprese 29 genů, které představují geny exprimované pouze v přítomnosti živé rostliny bramboru. Kromě toho bylo při 3 dpi výhradně exprimováno 27 genů a sekvenční čtení mapující malou sadu 21 genů byla výhradně detekovatelná při 8 dpi. Seznamy těchto genů spolu s jejich příslušnými hodnotami RPKM a popisy jsou uvedeny v doplňkových tabulkách 1 – 4.

Z 29 genů, které byly běžně exprimovány v přítomnosti živé rostliny bramboru, čtyři geny kódují proteiny zapojené do degradace buněčné stěny rostlin. To odpovídá virulenční strategii nekrotrofního patogenu se sekrecí enzymů degradujících buněčnou stěnu za účelem vyvolání nekrózy hostitelské buňky a úniku živin21. Kromě toho jeden gen kódující protein podílející se na degradaci bílkovin tuto linii útoku dále podporuje. Kromě toho jsou v tomto seznamu také dva geny kódující proteiny s DNA vazebnými doménami a předpokládanou funkcí v transkripční regulaci, které pravděpodobně hrají roli v transkripční regulaci útoku (např. Ben3g4553, viz tabulka 2). Většina z 27 genů exprimovaných výhradně při 3 dpi kóduje hypotetické proteiny, kterým nelze přiřadit žádnou předpokládanou funkci. Z 21 genů, které byly výhradně exprimovány v pozdějších fázích interakce (8 dpi), osm genů kóduje proteiny zapojené do degradace buněčné stěny rostlin a dva kódují proteázy. To opět ukazuje na typickou strategii nekrotrofního patogenu.

Shrnem lze říci, že první zkoumání transkriptomových dat tří odběrů odhalilo zřetelné a opodstatněné rozdíly, čímž se prokázal potenciál této studie najít faktory důležité pro vznik interakce mezi R. solani AG3-PT izolátu Ben 3 s náchylnou odrůdou bramboru a dalšímu postupu interakce.

Nejhojnější transkripty R. solani AG3-PT ve třech vzorcích

Mezidruhová interakce mezi R. solani AG3-PT izolátu Ben 3 se středně odolnou odrůdou bramboru ‚Arkula‘ byla nejprve hodnocena zkoumáním nejhojnějších transkriptů ve třech různých vzorcích. V rostoucím myceliu kultivovaném v tekuté kultuře byly nalezeny transkripty 11 206 genů genomu izolátu Ben3. Celkem bylo zjištěno 698 transkriptů těchto genů s mediánem RPKM 100 a vyšším, 37 s mediánem RPKM vyšším než 1000. V rané fázi interakce (3 dpi) klíčků hlíz s patogenem byly zjištěny transkripty 10 181 genů, přičemž 729 genů vykazovalo medián RPKM s hodnotami 100 a vyššími, 25 genů vykazovalo medián RPKM s hodnotami vyššími než 1000. U hlíz R. solani AG3-PT bylo přepsáno 9 939 genů, přičemž 742 genů vykazovalo hodnoty mediánu RPKM 100 a vyšší, 26 genů vykazovalo hodnoty mediánu RPKM vyšší než 1 000 v 8 dpi (doplňkové tabulky 5-7). Celkem bylo zjištěno, že 9 679 genů genomu izolátu Ben3 je exprimováno ve všech třech odběrech, mezi nimiž jsou nejhojnější transkripty v každém z jednotlivých analyzovaných odběrů. Pět z těchto nejvíce exprimovaných genů (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 a Ben3g675) kóduje hypotetické proteiny specifické pro R. solani s neznámou funkcí. Proto se neočekávalo, že by tyto proteiny hrály specifickou roli během interakce s rostlinou, tyto proteiny mohou být spíše důležité pro obecný růst a buněčný metabolismus. Mezi nejhojnější transkripty v jednotlivých odběrech patří také několik proteinů obsahujících lektinové domény (Ben3g9146, Ben3g9350 a Ben3g8869). Několik takových proteinů obsahujících lektinovou doménu typu ricinu beta-trefolia bylo také již dříve zaznamenáno jako nejhojnější u izolátu R. solani AG1-IB 7/3/14 během interakce s jeho hostitelskou rostlinou salátem30. Ačkoli specifická role těchto proteinů s lektinovou doménou není určena, bylo navrženo, že lektiny R. solani by mohly mít funkci zásobního proteinu v myceliu37. Kromě toho byly ve všech třech analyzovaných vzorcích silně transkribovány také dva geny kódující proteiny s thuringiensis toxinovou doménou (Ben3g8806, a Ben3g11931). Toxiny Bacillus thuringiensis jsou bakteriální proteiny známé svou biocidní aktivitou proti hmyzu38 , ale jejich cílem je i řada dalších organismů39. Silná exprese těchto homologů toxinové domény u R. solani naznačuje, že tyto toxiny mohou mít spíše obecný význam pro R. solani AG3-PT izolát Ben3 než hrát specifickou roli v interakci houby s rostlinou. Gen kódující protein uzávěru septálního póru (Ben3g7115) byl také mezi nejhojnějšími transkripty ve všech třech vzorcích, což naznačuje jeho podíl na homeostáze hyf u bazidiomycetózních hub40. Transkript podobný proteinu septální pórové čepičky (RSOLAG1IB_6054) byl také vysoce hojný v transkriptech izolátu R. solani AG1-IB 7/3/14 nalezených v bezpříznakové zóně interakce se salátem30. Tento protein specifický pro R. solani je součástí zátkového materiálu, který uzavírá perforace v čepičce septálních pórů hyfálních buněk a zabraňuje transportu cytoplazmatických tekutin mezi sousedními buňkami. Kromě toho byl gen kódující protein s hemopexinovou doménou (Ben3g6614) také mezi nejvíce exprimovanými geny společnými pro všechny tři vzorky. Tato doména označuje metaloproteinázy závislé na zinku, o nichž je všeobecně známo, že hrají důležitou roli v homeostatické regulaci extracelulárního prostředí41 , ale jejich biologické funkce mohou přesahovat i degradaci extracelulární matrix42. Vzhledem k tomu, že všechny tyto proteiny vykazovaly vysokou abundanci u R. solani AG3-PT s kontaktem s hostitelskou rostlinou i bez něj, mohou být důležité pro celkový růst a metabolismus, ale nezdá se, že by měly specifický význam v interakci houby s rostlinou.

Interakce mezi R. solani AG3-PT a hostitelskou rostlinou se projevuje v interakci s rostlinou. solani AG3-PT a bramborem

S cílem nalézt prvky s významem pro podporu interakce izolátu R. solani AG3-PT Ben3 s klíčky bramboru byla provedena diferenciální genová exprese integrovaná v platformě ReadXplorer (v2.2)43 . Toto párové srovnání transkriptomů čistého mycelia izolátu Ben3 s transkriptomy 3 dpi nebo 8 dpi interakce s klíčky bramboru bylo provedeno pomocí programu DESeq2. Geny byly přiřazeny jako diferenciálně exprimované s upravenou hodnotou P menší než 0,05 a minimální násobnou změnou |2| nebo více. Pomocí těchto kritérií bylo možné 592 genů přiřadit jako diferenciálně indukované ve 3 dpi (součet 242 genů výhradně časně indukovaných a 350 genů indukovaných ve 3 dpi a také v 8 dpi; early up), zatímco 520 genů je ve 3 dpi diferenciálně redukovaných (součet 412 genů výhradně časně redukovaných a 108 genů redukovaných ve 3 dpi a také v 8 dpi; early down). Při 8 dpi bylo zjištěno, že 688 transkriptů je diferenciálně indukovaných (součet 338 genů výhradně pozdně indukovaných a 350 genů indukovaných při 8 dpi a také při 3 dpi; late up) a 233 je diferenciálně redukovaných (součet 125 genů výhradně pozdně redukovaných a 108 genů redukovaných při 8 dpi a také při 3 dpi; late down). Pro porovnání a vizualizaci diferenciálně upregulovaných i downregulovaných genů v obou časových bodech během interakce byly sestrojeny Vennovy diagramy (obr. 2). Seznamy těchto genů spolu s příslušnými hodnotami jejich násobné změny jsou uvedeny v doplňkových tabulkách 8-9.

Rozdíly v expresi zjištěné touto analýzou DESeq2 byly ověřeny v pokusech pomocí qRT-PCR. Proto je třeba stanovit vhodný kontrolní gen s neměnným expresním vzorcem. Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (Ben3g7151, GAPDH), ubikvitin-konjugační enzym E2 (EUC63156, UBC), ubikvitin-protein ligáza E3 (Ben3g494, UBI), elongační faktor 2 (Ben3g3364, EF-2) a geny pro beta tubulin (Ben3g4099; TUB1) a (Ben3g5288, TUB2) byly testovány a gen beta tubulinu Ben3g5288 (TUB2) se v našich experimentech ukázal jako nejvhodnější referenční gen. Relativní hladiny transkriptů tří kandidátních genů s různými expresními vzorci byly normalizovány na základě exprese této invariantní kontroly. Byly vypočteny hodnoty ΔΔCq a porovnány s příslušnou analýzou DESeq2 (tabulka 2).

U všech tří kandidátních genů s velmi odlišným vzorcem exprese byly vypočtené hodnoty ΔΔCq v souladu s příslušnými hodnotami logaritmické změny vypočtenými v analýze DESeq2, čímž byla prokázána validita rozdílů v expresi.

Kromě toho byly provedeny anotace genové ontologie (GO) s cílem přiřadit jednotlivým genům příslušné funkce. V další analýze byl kladen zvláštní důraz na významně indukované geny, aby se přednostně zachytili molekulární kandidáti, kteří by mohli být důležití pro iniciaci a navázání interakce s rostlinou.

Diferencovaně exprimované geny (DEG) u izolátu Ben3 při 3 dpi klíčků bramboru

Diferencovaně indukované geny u izolátu Ben3 při interakci s klíčky bramboru při 3 dpi ve srovnání s čistým myceliem izolátu byly vybrány za předpokladu funkcí při iniciaci a podpoře procesu interakce s klíčky bramboru. Předpokládané funkce jednotlivých genových produktů a jejich rozdělení do společných aspektů GO pro biologický proces (BP), molekulární funkci (MF) a buněčnou složku (CC) jsou uvedeny na obr. 3.

Při 3 dpi jsou diferenciálně indukované geny přiřazeny především jako zapojené do metabolických procesů sacharidů a buněčných dusíkatých sloučenin a do transportu. Téměř 10 % (50 genů) rozdílně regulovaných genů kóduje různé peptidázové aktivity (např. Ben3g2070, viz tabulka 2), zatímco 53 genů kóduje enzymy degradující buněčnou stěnu včetně několika různých hydroláz působících na glykosylové vazby a pektátlyázy (např. Ben3g3530, viz tabulka 2.) nebo xylanázy. Za účelem další specifikace těchto enzymů degradujících buněčnou stěnu byly všechny DEG také anotovány podle databáze Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Doplňková tabulka 11). Sekrece velkého arzenálu hydrolytických enzymů, jako jsou proteasy a enzymy degradující buněčnou stěnu, je v průběhu interakce44,45 nezbytná k tomu, aby nekrotrofní houbové rostlinné patogeny, jako je R. solani, vyvolaly nekrózu buněk rozkladem strukturních bílkovinných a sacharidových složek buněčných stěn rostlin a způsobily únik živin9,30,46,47 . Předpokládá se tedy, že indukované enzymy degradující buněčnou stěnu a několik indukovaných peptidáz funguje při podpoře interakce R. solani AG3-PT s pletivem klíčku bramboru. Vylučované peptidasy však byly také rozsáhle studovány z hlediska jejich role jako efektorů gramnegativních bakterií48 a také hub47,49 . Efektory patogenů jsou obvykle dodávány jako faktory virulence do buněk hostitele, aby potlačily základní obranné reakce a vytvořily vhodné prostředí pro šíření patogenu50,51,52. Posttranslační modifikace hostitelských proteinů prostřednictvím proteolytického zpracování je tedy široce využívaným mechanismem při regulaci obranné reakce rostlin. Při současném stupni poznání lze předpokládat, že jedna nebo více z těchto indukovaných proteas má předpokládanou roli efektorů, které podporují interakci R. solani AG3-PT na hostiteli bramboru. K jasnému přiřazení jejich funkční role v interakci patogenu s hostitelem jsou však zapotřebí další funkční analýzy jednotlivých proteáz.

Další velká skupina složená ze 100 členů diferenciálně regulovaných genů interakce ve 3 dpi je popsána jako skupina kódující hypotetické proteiny. Většina těchto genů je specifická pro R. solani a jejich homology bylo možné nalézt v dalších pěti anotovaných genomech R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8 a R. solani AG1-IA a AG1-IB. Z naší analýzy diferenciální genové exprese vyplývá, že některé z těchto genů se podílejí na podpoře interakce R. solani AG3-PT na klíčku bramboru. Je již známo, že sekretované efektory houbových patogenů se zaměřují na imunitu hostitele pomocí různých strategií, např. hydrolyzací prekurzoru kyseliny salicylové53 nebo vazbou na transkripční faktory, čímž inhibují jejich aktivitu54. K odhalení předpokládaných funkcí dosud hypotetických proteinů pro jejich různé možné role v interakci R. solani AG3-PT s bramborem jsou zapotřebí další analýzy.

Zajímavé je, že nejsilněji diferencovaný gen (Ben3g6247) je homologní s proteiny rodiny LTE (lipid-translocating exporter), jako je RTA1 ze Saccharomyces. Protein RTA1 obsahuje sedm potenciálních membránových segmentů55 a předpokládá se, že je integrálním membránovým proteinem s funkcí v odolnosti buněk vůči xenobiotikům56. Další geny rodiny LTE mohou kódovat transportéry nebo senzory, které usnadňují vylučování biosyntetických meziproduktů, a to buď přímo, nebo nepřímo56. Tyto předpokládané funkce proteinů rodiny LTE činí z genu Ben3g6247 oblíbeného kandidáta podílejícího se na vylučování složek důležitých pro napadení patogenem.

Raná fáze nekrotrofní interakce je spojena s buněčnou smrtí rostlinného hostitele a produkcí různých sekundárních metabolitů a hromaděním reaktivních forem kyslíku21. Bylo prokázáno, že antioxidační procesy a exprese příslušných genů byly korelovány s nekrotickými pletivy v několika patosystémech R. solani (klíčky brambor – R. solani AG3; hypokotyl sóji – R. solani AG4 a listy sóji – R. solani AG1-IA)27 . V rané fázi interakce hostitele bramboru s izolátem Ben3 (3 dpi) nebylo možné na transkripční úrovni pozorovat žádný silný důkaz indukce antioxidačních procesů v hyfách patogenu, protože nedošlo k silnému zvýšení exprese genů glutathion S-transferázy ani k upregulaci dalších genů, o nichž je známo, že se podílejí na vychytávání reaktivních forem kyslíku. Proto lze postulovat, že v našem systému kolonizace klíčku bramboru R. solani AG3-PT se analýza tkáně ve 3 dpi podobá rané fázi interakce s rostlinným patogenem možná před infekcí tkáně klíčku. V tomto časovém bodě nebyly pozorovány žádné viditelné symptomy.

Diferenciálně exprimované geny u izolátu Ben3 v 8 dpi klíčků bramboru

S cílem nalézt transkripty, které jsou důležité v pokročilé fázi interakce, byl proveden screening diferenciálně indukovaných genů mezi čistým myceliem izolátu Ben3 a Ben3 přitahovaným ke klíčkům bramboru v 8 dpi. Příslušné funkční anotace genových produktů a jejich rozdělení do společných znaků GO jsou uvedeny na obr. 4. V 8 dpi jsou diferenciálně indukované geny přiřazeny především k těm, které se podílejí na metabolických procesech sacharidů a makromolekul a na transportu. V této pozdější fázi interakce je upregulováno 152 genů (> 22 %), které kódují různé enzymy degradující buněčnou stěnu (např. Ben3g3530, viz tab. 2). Kromě toho byly všechny DEG anotovány také podle databáze Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (doplňková tabulka 11). Tato zvýšená exprese genů kódujících hydrolytické enzymy buněčné stěny pěkně demonstruje zvyšující se patogenní aktivitu izolátu Ben3 a také význam rozkladu složek buněčné stěny pro přístup k živinám v průběhu interakce, čímž potvrzuje popsanou virulenční strategii nekrotrofního patogenu21,57 . Tato destruktivní taktika byla doprovázena indukcí exprese genů kódujících integrální složky membrán. Tyto 154 většinou necharakterizované integrální membránové proteiny a domnělé transportéry se pravděpodobně podílely na příjmu živin a degradačních produktů hydrolázových aktivit. V této fázi interakce se zdálo, že převažující význam genů kódujících peptidázy klesá, ale stále bylo diferenciálně upregulováno 33 genů kódujících peptidázy (např. Ben3g2070, viz tabulka 2). To lze vysvětlit také tím, že byly sklizeny celé klíčky, včetně klíčků s až 8denní interakcí s náročným patogenem a následně vznikajících klíčků s kratší dobou interakce. Obecně je to také zastoupeno v 350 genech, které byly společně diferenciálně zvýšeny ve 3 a 8 dpi (obr. 2).

Další velkou skupinu DEG při 8 dpi navíc tvoří 98 genů s neznámou funkcí. Vzhledem k tomu, že tyto geny jsou specifické pro Rhizoctonia bez oblastí podobnosti se sekvencemi s přiřazenými funkcemi, lze o jejich roli v podpoře interakce patogenu s rostlinou pouze spekulovat. Další funkční porovnání těchto genů a např. jejich rozdílná exprese v příslušných patosystémech by mohly napovědět o jejich domnělé funkci.

Ve zde popsaném experimentálním systému kolonizace klíčků bramboru izolátem R. solani AG3-PT se léze Ben3 poprvé projeví v 8 dpi. V jiných experimentech25,27 bylo prokázáno, že nekrotrofní interakce a buněčná smrt v rostlinném hostiteli korelovaly s expresí příslušných genů v rostlině a v houbě. Samsatly a spolupracovníci27 prokázali pomocí kvantitativní RT-PCR, že exprese antioxidačních genů kódujících glutathion S-transferasu a katalasu byla u R. solani AG3 pět dní po inokulaci oddělených klíčků bramboru významně zvýšena. Takto silně zvýšenou expresi těchto antioxidačních genů však nebylo možné ve zde popsaných pokusech zjistit. Důvody těchto rozdílů by mohly být způsobeny inokulací pomocí izolátů R. solani AG3 vykazujících rozdíly v patogenitě. Dalším rozdílem je však skutečnost, že Samsatly a spol.27 prováděli pokusy s oddělenými klíčky v omezeném systému in vitro, zatímco naše experimentální uspořádání plně odráží podmínky prostředí in vivo s pěstováním klíčků na kultivovaných hlízách semen. Další výzkumy spolu se souběžnou analýzou transkriptomu v hostiteli bramboru konečně zvýší pochopení vzájemného vztahu v interakci hostitelského patogenu v prostředí připomínajícím přirozenou situaci.

Diferencovaně exprimované geny u izolátu Ben3 při porovnání 3 a 8 dpi klíčků bramboru

K rozlišení mezi R. solani AG3-PT transkripty, které byly důležité hlavně v raném časovém bodě, a těmi, které se stávají důležitějšími v pokročilých fázích interakce, byly pomocí DESeq2 analyzovány také diferenciálně exprimované geny mezi 3 a 8 dpi interakce. Pomocí výše uvedených kritérií s upravenými P-hodnotami menšími než 0,05 a minimální násobnou změnou |2| nebo více bylo možné 173 genům přiřadit diferenciálně sníženou expresi mezi 3 a 8 dpi, zatímco 400 genů je diferenciálně zvýšeně exprimováno v pozdějším časovém bodě. Kompletní seznamy těchto genů spolu s jejich příslušnými hodnotami baseMean a hodnotami fold change jsou uvedeny v doplňkové tabulce 10, seznamy 20 nejvíce diferenciálně exprimovaných genů mezi 3 a 8 dpi jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4. Zatímco 10 z 20 nejvíce diferenciálně redukovaných genů mezi 3 a 8 dpi kóduje proteiny zapojené do degradace proteinů a příjmu a asimilace dusíku (tabulka 3), většina genů s diferenciálně zvýšenou expresí mezi 3 a 8 dpi se podílí na degradaci polysacharidů se zaměřením na měď-dependentní lytické polysacharidové monooxygenázy pro štěpení celulózových řetězců s oxidací různých uhlíků (tabulka 4).

Je známo, že metabolismus dusíku a exprese genů regulovaných dusíkem u rostlinných patogenních hub má velký význam pro vznik choroby v hostitelské rostlině58. Dusičnany jsou však méně preferovaným zdrojem dusíku ve srovnání s amoniem a L-glutaminem, pokud jde o využití živin u hub, přinejmenším během infekce listů59. U hub je toto preferované využití živin regulováno prostřednictvím represe dusíkatých metabolitů a zajišťuje transkripci genů kódujících aktivní permeasu amoniaku a močoviny. Kromě silné přechodné exprese genů kódujících permeasy transportující amoniak a dusíkaté sloučeniny (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 a Ben3g7775) v raném stádiu interakce ve 3 dpi působil izolát R. solani AG3-PT Ben3 také vysokou indukci a expresi genů zapojených do příjmu a asimilace dusičnanů (Ben3g6360, Ben3g6359 a Ben3g6361). Zda se jedná o charakteristický rys izolátu Ben3 nebo o vlastnost půdních rostlinných patogenních hub, by bylo třeba dále zkoumat.

Většina genů s diferenciálně zvýšenou expresí mezi 3. a 8. dpi se podílí na degradaci buněčné stěny a kóduje hydrolázy působící na glykosylové vazby a pektátlyázy. To se očekávalo a opět to dokazuje rostoucí význam rozkladu složek buněčné stěny určující strategii virulence nekrotrofního patogenu21.

.