Mikrojádra
MN vznikají z fragmentů chromozomů nebo celých chromozomů, které se během jaderného dělení opožďují za anafází a nejsou součástí hlavních jader.13,18,19 MN jsou malá extranukleární tělíska, která vznikají v dělících se buňkách z acentrických fragmentů chromozomů/chromatidů nebo celých chromozomů/chromatidů, které zaostávají při anafázi a nejsou zahrnuty do dceřiných jader v telofázi.20 V telofázi se kolem opožděných chromozomů a fragmentů vytvoří jaderný obal, který se pak rozbalí a postupně získá morfologii interfázního jádra, až na to, že jsou menší než hlavní jádra v buňce (odtud termín „mikrojádro“).19 MN ukrývající chromozomální fragmenty mohou vzniknout přímým dvouřetězcovým zlomem DNA, přeměnou jednořetězcových zlomů na dvouřetězcové zlomy po replikaci buňky nebo inhibicí syntézy DNA.20
MN mohou vznikat různými cestami: konkrétně z acentrických chromozomových nebo chromatidových fragmentů. Malá část acentrických chromozomových fragmentů může jednoduše vzniknout z neopravených dvouřetězcových zlomů DNA. Mezi další mechanismy, které mohou vést ke vzniku MN z acentrických fragmentů, patří simultánní excizní opravy poškozených (např. 8-oxo-deoxyguanosinu) nebo nevhodných bází začleněných do DNA (např. uracilu), které se nacházejí v blízkosti a na opačných komplementárních vláknech DNA.21 Dalším mechanismem, který může vést ke vzniku MN v důsledku ztráty chromozomů, je hypometylace cytosinu v centromerických a pericentromerických repeticích, jako jsou klasické satelitní repetice v pericentromerických oblastech a satelitní repetice DNA vyššího řádu v centromerické DNA.21 Vzhledem k ústřední roli proteinů kinetochoru při zapojování chromozomů do vřeténka je pravděpodobné, že mutace vedoucí k defektům v dynamice interakce kinetochoru a mikrotubulů mohou být příčinou vzniku MN v důsledku ztráty chromozomů v anafázi. Dalšími proměnnými, které pravděpodobně vedou ke zvýšení MN v důsledku ztráty chromozomů, jsou defekty v sestavení mitotického vřeténka, defekty kontrolních bodů mitózy a abnormální amplifikace centrozomů.21
Osud MN po jejich vzniku v mikrojaderné buňce je málo známý. Jejich postmitotický osud zahrnuje: (1) eliminaci mikrojaderné buňky v důsledku apoptózy; (2) vyloučení z buňky (když se předpokládá, že DNA uvnitř MN není funkční nebo schopná replikace kvůli absenci nezbytných cytoplazmatických složek); (3) opětovné začlenění do hlavního jádra (kdy znovu začleněný chromozom může být nerozeznatelný od chromozomu hlavního jádra a může obnovit normální biologickou aktivitu); a (4) ponechání v cytoplazmě buňky jako extranukleární entita (kdy MN může dokončit jedno nebo více kol replikace DNA/chromozomu).20,22
Klíčová výhoda testu CBMN spočívá v jeho schopnosti odhalit jak klastogenní, tak aneugenní události, které vedou ke strukturním, respektive numerickým chromozomálním aberacím.20 Klastogeny vyvolávají MN tím, že rozbíjejí dvojitou šroubovici DNA a vytvářejí acentrické fragmenty, které nejsou schopny přilnout k vláknům vřeténka a integrovat se v dceřiných jádrech, a proto jsou během mitózy vynechány. Totéž se děje celým chromozomům s poškozenými kinetochory; nemohou se připojit k mikrotubulům, které během mitózy táhnou chromatidy směrem k dceřiným buňkám, a tak zůstávají mimo nová jádra. Toto poškození by mohlo vzniknout reakcí chemických látek s proteiny tvořícími kinetochory.23,24
Aneugeny jsou chemické látky, které zabraňují tvorbě vřetenového aparátu během mitózy. Tyto látky vytvářejí nejen celé chromatidy, které zůstávají mimo jádra, čímž vznikají MN, ale také vznik vícejaderných buněk, v nichž by každé jádro obsahovalo jiný počet chromozomů. Tyto látky také pravděpodobně vyvolávají nárůst mitotických figur, které jsou jasně patrné na stejných preparátech. Pomocí testu CBMN je možné pomocí centromerických sond rozlišit mezi MN pocházejícími z celých chromozomů a těmi, které pocházejí z acentrických fragmentů, a také určit, zda dochází k malsegregaci chromozomů mezi jádry v dvoujaderné buňce, která nemusí obsahovat MN.8,10,19
Pancentromerické DNA sondy se používají k rozlišení mezi MN pocházejícími z jakékoli události ztráty celých chromozomů a MN obsahujícími acentrické fragmenty chromozomů. Použití chromozomově specifických centromerických DNA sond umožňuje jak určení specifických událostí ztráty chromozomů vedoucích k MN, tak nerovnoměrnou segregaci specifických chromozomů mezi dceřinými jádry i v případě, že nedojde ke vzniku MN.21 Pancentromerické sondy by se měly používat pouze k rozlišení mezi MN pocházejícími ze zlomů chromozomů (centromery negativní) a ztrátou chromozomů (centromery pozitivní). Chromozomově specifické centromerové sondy by se měly používat pouze k měření malsegregace (v důsledku nondisjunkce nebo ztráty chromozomů) zahrnující jedinečné chromozomy.8,10,19,21,25 Hodnocení mechanistického původu jednotlivých MN pomocí identifikace centromer a kinetochorů přispívá k vysoké citlivosti a specifičnosti metody.20
Důležité faktory ovlivňují základní frekvenci MN v lidských lymfocytech. Věk a pohlaví jsou nejdůležitější demografické proměnné ovlivňující index MN; frekvence u žen je vyšší než u mužů 1,2-1,6krát v závislosti na věkové skupině.26 Frekvence MN byla významně a pozitivně korelována s věkem u mužů i žen a je ovlivněna dietními faktory, jako je nedostatek folátu a plazmatické hladiny vitaminu B12 a homocysteinu. Bylo také navrženo, že index MN může být ovlivněn sklonem buněk jedince k apoptóze a genetickými faktory, jako jsou genetické polymorfismy.10,20,27
V obecné podobě se vznik MN připisuje různým inzultům genetického materiálu, které lze klasifikovat jako exogenní a endogenní faktory. Mezi exogenní faktory patří záření, chemické látky a invaze mikroorganismů. Endogenní faktory zahrnují genetické defekty, patologické změny, nedostatek základních nutričních složek (např. kyseliny listové) a poškození vyvolaná škodlivými metabolickými produkty (jako jsou reaktivní formy kyslíku).28
Hypotézu o prediktivní souvislosti mezi četností MN v testu CBMN v lymfocytech a vznikem rakoviny podporuje řada zjištění: (1) souvislost mezi frekvencí MN a rizikem vzniku rakoviny byla vyvozena z mechanistické podobnosti s chromozomálními aberacemi, které se ukázaly jako prediktivní pro vznik rakoviny; (2) in vitro je pozorována vysoká shoda mezi chromozomálními aberacemi a MN; (3) zvýšení frekvence MN je pozorováno v lymfocytech pacientů s rakovinou a u pacientů se syndromy, které je činí náchylnými k rakovině, jako je Bloomův syndrom a ataxia telangiectasia; (4) frekvence MN významně souvisí s koncentrací vitaminů v krvi, jako je folát, jehož nedostatek je spojen se zvýšeným rizikem některých druhů rakoviny; (5) existuje přímá souvislost mezi frekvencí MN a časnými stádii karcinogeneze: Konkrétně se jedná o významnou souvislost mezi zvýšenou frekvencí MN a diagnostickými kategoriemi karcinogeneze děložního čípku nízkého a vysokého stupně u žen.20
Tvorba jaderných anomálií, jako jsou MN, chromozomální přestavby a anafázové můstky (vedoucí k cyklům zlom-fúze-můstek a tvorbě dalších MN), jsou události běžně pozorované v časných stadiích karcinogeneze. Zvýšené hladiny MN ukazují na defekty v opravě DNA a segregaci chromozomů, které by mohly vést ke vzniku dceřiných buněk se změněnou dávkou genů nebo k deregulaci genové exprese, což by mohlo vést k vývoji fenotypu nestability chromozomů, který je často pozorován u rakoviny. Tyto úvahy mechanicky podporují možnou příčinnou souvislost mezi frekvencí MN a rizikem vzniku rakoviny. Studie Bonassiho a spol.29 pozorovala souvislost mezi frekvencí MN a rizikem rakoviny u nehematologických malignit, což naznačuje, že události poškození genomu v lymfocytech mohou být korelovány s událostmi iniciujícími rakovinu v jiných tkáních prostřednictvím společného genetického, dietního nebo environmentálního faktoru.