Microbiology & Experimentation

V této studii byla provedena izolace a charakterizace bakteriálních kmenů ze skládek Barrackpore Municipality a Dhapa. Růst bakterií závisí na různých fyzikálně-chemických podmínkách, jako je médium, pH, teplota, inkubační doba, zdroj uhlíku atd. Proto by se měly studovat různé podmínky, za kterých bakterie rostou v přirozeném prostředí, než se přistoupí k masivnímu množení pro použití jako rozkladače. Proto byly vzaty v úvahu následující parametry:

Fyzikální a chemické vlastnosti tuhého komunálního odpadu

Bakterie mohou růst v širokém rozsahu vlhkosti. V této studii bylo zjištěno, že vlhkost odebraného vzorku z obce Barrackpore a skládky Dhapa byla přibližně 65,32 % a 66,45 %. Bakteriální populace různých půd úzce souvisí s jejich vlhkostí. Maximální hustota bakterií se vyskytuje v oblastech s poměrně vysokým obsahem vlhkosti a optimální úroveň pro činnost aerobních bakterií je často 50-75 % vlhkostní kapacity půdy.1 Počty rodů Pseudomonas, Achromobacter a Bacillus se vyskytují ve většině aerobních půd; tam, kde jsou podmínky anaerobní a vlhké, se objeví Clostridium. Podobný kvantitativní nárůst v takových podmínkách vykazují i aktinomycety.15

V této studii bylo pH dvou vybraných médií (BCDA a NA) optimalizováno pro kultivaci bakteriálních kmenů. Ph odebraného vzorku bylo v obou případech 7,79. Hodnota pH je klíčovým faktorem pro pěstování bakterií v umělých médiích. Optimalizace pH byla provedena u dvou vybraných médií, a to Nutrient Agar (NA) A Basic czapek dox agar (BCDA). Bylo zjištěno, že NA a BCDA o pH 7,2 a 7,6 jsou vhodné pro maximální růst bakteriálních kmenů. Z výsledků bylo zjištěno, že pH vzorku bylo přibližně 7,79 a možná z tohoto důvodu bylo také zjištěno, že tyto kmeny rostou dobře in, in vitro při pH 7-8 v BCDA a NA. Bakterie mohou tolerovat půdní reakci v rozmezí pH 4 až 10, ale nejpříznivější pH pro většinu je právě alkalická strana až neutralita. Bakterie jako Thiobacillus thiooxidans a Acetobacter sp. jsou schopny růst při velmi nízkých hodnotách pH mezi úrovní pH 0 a 2 a některé Bacillus sp. mohou růst i při pH 11.15 Optimální růst Thermoactinomycetes probíhá při pH 8 nebo 9 a je značně potlačen reakcí kolem pH 516. Vibrio, Streptococcus faecalis a Escherichia coli rovněž tolerují alkalickou reakci (pH 8-9).16

Na počátku byl studován obsah NPK ve vzorku. Bylo zjištěno, že obsah organických látek byl 27,84 % (obec Barrackpore) a 29,32 % (Dhapa), obsah dusíku v % byl 0,165 (obec Barrackpore) a 0,179 (Dhapa), obsah fosforu v % byl 0,502 (obec Barrackpore) a 0,545 (Dhapa) a obsah draslíku v % byl 18,29 (obec Barrackpore) a 19,21 (Dhapa). Všechny tyto analýzy poskytly jasnou představu o přirozeném prostředí bakterií, a byly tak určujícími faktory při izolaci a kultivaci kmenů.

Kultivační charakteristiky bakteriálních izolátů

V naší studii bylo v kultivačních médiích izolováno BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 a C3 -těchto 9 bakteriálních kmenů. K určení nejvhodnějších médií pro zajištění masivního růstu izolovaných kmenů byly vybrány Czapek dox agar a Nutrient agar. czapek dox agar (BCDA) byl vhodný pro masivní růst BM3, D1,C2 a Nutrient agar (NA) médium bylo vhodné pro masivní růst BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Bylo zjištěno, že média obsahující kvasničný extrakt xylan byla vhodná pro maximální růst bakterií, ale Pseudomonas sp., Bacillus spp., Aeromonas sp. rostou dobře na živném agarovém médiu. K charakterizaci vybraných kmenů bylo použito vizuální a mikroskopické pozorování. Podrobnosti o vlastnostech kolonií bakterií jsou zaznamenány (tabulka 1). Barvení podle Grama je stará a spolehlivá metoda pozorování bakterií. Gramnegativní bakterie byly odbarveny alkoholem, čímž ztratily fialové zbarvení krystalové violeti. Grampozitivní bakterie se neodbarvily a zůstaly fialové.

V tomto šetření, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 a C3 -těchto 9 bakteriálních kmenů bylo izolováno a byla provedena jejich mikrobiologická charakterizace. Výsledky ukázaly, že BM1, BM3, D1 jsou grampozitivní bacily, BM2 jsou grampozitivní krátké bacily, D2 jsou grampozitivní diplobacily, D3, C2 jsou gramnegativní bacily, D4 jsou gramnegativní krátké bacily a C3 je grampozitivní kok. U 9 izolátů byly rovněž provedeny různé biochemické testy, aby se zjistily jejich biochemické vlastnosti. Podrobnosti o biochemických znacích bakterií jsou uvedeny v tabulce 2.

Výše uvedené výsledky poskytly představu o morfologii, charakteristice kolonií a biochemické povaze izolovaných kmenů, což by v budoucnu pomohlo při identifikaci a charakterizaci izolovaných bakteriálních kmenů.

Optimalizace růstových podmínek

V tomto šetření byl růst izolovaných kmenů pozorován na různých růstových médiích, jako jsou NA, ACDA a BCDA. Bylo zjištěno, že základní čapek dox agar (BCDA) byl vhodný pro masivní růst BM3, D1, C2 a živné agarové médium (NA) bylo vhodné pro masivní růst BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

V tomto experimentu byly bakteriální kultury 9 kmenů inkubovány při různých teplotách, jako jsou 25, 29, 34, 37 a 40 °C.

Bakteriální kultury byly inkubovány při různých teplotách. Optimální růst všech kmenů byl zjištěn při 37 °C. Optimální teplotní rozmezí pro bakterie je přibližně 25-36 °C. Velký počet bakterií může poměrně dobře růst při teplotě nad 10-4 °C.6 Sultana17 pozoroval, že teplota 33±4 °C je ideální pro růst bakterií.17 Některé bakterie se nejintenzivněji vyvíjejí při teplotách pod 20 °C. Termofily dobře rostou při teplotách 45-65 °C a některé termofily se nejsou schopny množit při teplotách nižších než 40 °C.1

Kmeny získané v této studii byly inkubovány po různé inkubační doby (6, 12, 24, 36, 48 a 72 h). Inkubační doba 24 h byla vhodná pro BM1, BM2, D2, D3, D4, C3, zatímco u BM3, D1 a C2 byla zjištěna vhodnost inkubační doby 36 h. Koliformní bakterie rostou při inkubační době 24 ± 2 h a při 32 °C a vykazují dobrý růst při 37 °C po dobu 48 h inkubace. Při vizuálním pozorování bylo zjištěno, že po 24 h inkubace byla barva BM2 světle oranžová, BM1 bílá a BM3 krémově bílá v jejich preferovaném médiu (BCDA a NA). Po 48-72 h inkubace byla barva BM2 oranžová, BM1, D1 žlutá, C2 červená a BM3, D2, D3, D4, C3 zůstaly krémově bílé. Kolonie kmenů BM1, BM2, D2 a D4 byly vlhké a ostatní byly krémové. Stafylokoky a mikrokoky vytvářejí na běžných médiích zlatohnědé, žluté nebo bílé kolonie. Některé enterokoky, koryneformy a enterobakterie mohou na běžných médiích vytvářet černé kolonie.8

Test antagonismu

K určení antagonismu mezi bakteriálními kmeny pro jejich budoucí použití v různých aspektech byla použita metoda křížového proužkování. Podrobnosti o antagonismu v rámci bakteriálních izolátů jsou popsány (tabulka 3).

BM2 má antagonismus se všemi ostatními kmeny, takže není možné vytvořit konsorcium s použitím tohoto kmene jako jednoho z izolátů. D1, D3 mají také antagonismus s většinou ostatních kmenů. BM1 je nejsilnějším kmenem, protože nemá antagonismus s žádným z ostatních izolátů. BM3, D2, D4, D5 a D6 mají antagonismus s několika izoláty a tyto kmeny spolu s BM1 mohou být testovány v různých kombinacích pro přípravu konsorcia.

Toleranční test na těžké kovy

Pět těžkých kovů (As, Zn, Pb, Hg, Cd) bylo vybráno pro stanovení schopnosti izolovaných bakteriálních kmenů tolerovat kovy (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). Toleranční test ukázal, že z pěti zkoumaných těžkých kovů byla maximální tolerance prokázána k Pb, který vykazoval růst mikroorganismů až do 4000 ppm, a minimální tolerance k Cd, který nevykazoval růst nad 30 ppm. MIC byla zaznamenána, když izoláty nerostly na destičkách ani po 10 dnech inkubace. Z výsledků vyplývá, že u všech tří bakterií se MIC pohybovala v rozmezí 250ppm až 350ppm pro As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) a Pb (3000-4000ppm) (tabulka 4). V této studii byla nejvyšší tolerance As a Cd zjištěna u BM1, zatímco nejvyšší tolerance Zn byla pozorována u BM2 a BM3 vykazoval maximální akumulaci Hg a Pb. V naší studii je nejtoxičtějším kovem (s nejnižší MIC) cd, zatímco nejméně toxickým testovaným kovem je Pb (tab. 4).

MIC byla zaznamenána, když izoláty nerostly na plotnách ani po 10 dnech inkubace.18 Mergeay a spol.19 testovali minimální inhibiční koncentrace (MIC) několika různých kovů a zjistili, že nejtoxičtějším kovem (s nejnižší MIC) byla rtuť, zatímco nejméně toxickým kovem byl mangan.19 Mikrobiální tolerance při jednotlivých koncentracích těžkých kovů byla znázorněna testem cup assay. Průměr inhibiční zóny kolem každého kalíšku se zvětšoval s rostoucí koncentrací těžkých kovů, což svědčí o toxickém účinku těžkých kovů na růst mikroorganismů. Městský úřad Barrackpore a skládka Dhapa shromažďují veškerý tuhý domovní i průmyslový odpad z města Barrackpore, resp. z města Kalkata a jeho okolí. Odpad pocházející z domácností a průmyslu je vhodným prostředím, kde si mikroorganismy mohou vyvinout odolnost vůči těžkým kovům. Přítomnost malého množství těžkých kovů v pevném odpadu může vyvolat vznik mikroorganismů odolných vůči těžkým kovům. Rezistence mikroorganismů vůči těžkým kovům se připisuje různým detoxikačním mechanismům vyvinutým rezistentními mikroorganismy, jako je komplexace exopolysacharidy, vazba s buněčnými obaly bakterií, redukce kovů, eflux kovů atd. Tyto mechanismy jsou někdy zakódovány v plazmidových genech, které usnadňují přenos rezistence vůči toxickým kovům z jedné buňky na druhou.20 Organismus odolný vůči těžkým kovům by mohl být potenciálním prostředkem pro bioremediaci znečištění těžkými kovy. Vzhledem k tomu, že všechny těžké kovy mají podobný toxický mechanismus, je u bakterií rezistentních vůči těžkým kovům běžným jevem tolerance k více kovům.21

Test citlivosti na antibiotika

Test citlivosti na antibiotika pomáhá určit, jak účinné je antibiotikum proti testovanému organismu. U 9 izolátů byla zjišťována citlivost vůči čtyřem antibiotikům a výsledek je zaznamenán (tabulka 5). Většina izolátů produkuje antimikrobiální sloučeniny, které mohou sloužit lékařské vědě. D1, D3 a D5 nevykazovaly žádnou antimikrobiální aktivitu.

Test antimikrobiální aktivity

Produkce antimikrobiálních látek se zdá být obecným jevem pro většinu bakterií. V této studii vykazovaly 3 izoláty antibakteriální aktivitu a 5 izolátů antifungální aktivitu, ale 3 izoláty nevykazovaly ani antibakteriální, ani antifungální aktivitu proti patogenům. Výsledek byl znázorněn (tabulka 6). Podobnou studii uvedli Subramaniam a kol.22 Příslušníci rodu Bacillus produkují celou řadu antimikrobiálních sloučenin, mnohé z nich byly identifikovány jako peptidy, lipopeptidy a fenolové deriváty. Hledání nových sekundárních metabolitů s různorodou biologickou aktivitou v rozmanitém prostředí získalo v posledních letech větší pozornost.

Tvorba extracelulárních enzymů

S rostoucím povědomím o ochraně životního prostředí získalo využití enzymů, zejména z extremofilů, značnou pozornost v mnoha průmyslových procesech. V posledních letech mikrobiální enzymy nahrazují chemické katalyzátory při výrobě chemických látek, textilií, léčiv, papíru a potravinářských zemědělských chemikálií. Průmyslové bioprocesy založené na enzymech nyní přímo konkurují zavedeným chemickým procesům. V této studii však bylo 9 izolátů podrobeno kvalitativnímu testu na produkci osmi různých enzymů, jako jsou proteáza, lecitináza, DNáza, lipáza, celuláza, amyláza, kataláza a oxidáza. Podobnou studii provedli Subramani a Narayanasamy.23 Zajímavé je, že v naší studii 6 z nich vykazovalo produkci enzymu proteázy, který má vysokou tržní hodnotu. Všech 9 kmenů produkovalo enzym katalázu a oxidázu. Výsledek je uveden v tabulce 7.

Proteázový test

6 kmenů (BM1, BM3, D1, D3, C2 a C3) z 9 izolátů vykazovalo produkci proteáz. Protože proteáza má široké uplatnění v potravinářství, detergentním průmyslu, farmaceutickém průmyslu i při rozkladu pevných odpadů, byla provedena kvantitativní analýza produkované proteázy. Byla stanovena aktivita takto produkovaného enzymu proteázy a výsledek byl vyjádřen v IU/ml. Výsledek je znázorněn v tabulce 8. Kvantitativní test proteázy neomylně prokázal, že ze 6 kmenů produkuje proteázu s vysokou hodnotou titru kmen BM1 a Gupta et al,24 podobně uvádějí produkci alkalické proteázy z bakteriálních druhů a její průmyslové využití.

Potenciál rozkladu odpadu izolovanými bakteriemi

Enzym proteáza má široké uplatnění při rozkladu odpadu. Proto bylo 6 kmenů schopných produkovat enzym proteázu podrobeno testu účinnosti rozkladu odpadu. V naší studii lze pozorovat, že BM1 má nejvyšší degradační potenciál následovaný BM3. BM1 je také silným producentem proteázového enzymu, takže má také lepší schopnost rozkladu (obr. 1). Jak je odpad rozkládán mikroorganismy (bakteriemi), hmotnost podestýlky se snižuje. V této studii rozkladu jsme pozorovali, že hmotnost zpracovaného steliva se snížila, protože jej bakterie rozložily a přeměnily na jednoduché molekuly. Procento úbytku hmotnosti vzorků odpadu se zvyšovalo s postupujícím procesem rozkladu, jak je vidět na obrázku 1. Podobné pozorování uvedl Zaved et al.25 při studiu úbytku hmotnosti odpadků specifickými bakteriemi v Bangladéši. V naší studii lze pozorovat, že BM1 má nejvyšší rozkladný potenciál následovaný. BM1 lze tedy účinně využít pro bioremediaci pevných odpadů.

.