Kryptochromy

Cirkadiánní biologické hodiny jsou biochemické oscilátory, které se cyklicky opakují přibližně každých 24 hodin a které lze resetovat (uvést do chodu) působením světla a dalších signálů prostředí. U živočichů existuje centrální oscilátor v mozku, který řídí cirkadiánní chování celého organismu, a také periferní oscilátory v některých tkáních. Oscilace vzniká na základě transkripční zpětnovazební smyčky zahrnující soubor hodinových transkripčních faktorů, včetně časových (Tim), periodických (Per), hodinových (Clk) a Bmal1, jakož i kryptochromů. Kryptochromy jsou všudypřítomně exprimovány v orgánech a tkáních všech organismů a obecně se jedná o jaderné proteiny, které regulují genovou expresi. Nejlépe prostudovanými živočišnými kryptochromy jsou drozofilní kryptochrom Cry a myší kryptochromy Cry1 a Cry2 , rozsáhle byly studovány také dva kryptochromy Arabidopsis CRY1 a CRY2.

Drozofilní kryptochromy

Drozofilní Cry je převážně jaderný protein, který zprostředkovává regulaci cirkadiánních hodin světlem , i když se může nacházet také v cytosolu. Reguluje cirkadiánní hodiny přímou interakcí s proteinem Tim, čímž potlačuje negativní zpětnovazební smyčku hodin (obr. 3a). Světlo stimuluje interakci Cry-Tim, která podporuje ubikvitinaci a degradaci Timu závislou na proteosomech a potlačuje tvorbu heterodimeru Per-Tim. Inhibice heterodimeru proteinů Clock a Cycle heterodimerem Per-Tim je tak uvolněna a fáze cirkadiánní oscilace je resetována (obr. 3a). Kryptochrom však zřejmě není jediným fotoreceptorem, který u drozofily řídí cirkadiánní hodiny. Rytmicita chování crybmutantní mouchy, která postrádá funkci Cry, může být přesto entraindována v reakci na světlo, pokud není eliminován také přenos signálu zrakovým pigmentem . Kromě své role fotoreceptoru pro entrainment centrálního oscilátoru drozofily má Cry také roli nezávislou na světle ve funkci periferního cirkadiánního oscilátoru .

Savčí kryptochromy

Dvě funkce drozofilního Cry – jako fotoreceptor pro entrainment cirkadiánních hodin spolu se zrakovými pigmenty a jako integrální součást komplexu proteinů cirkadiánního oscilátoru – jsou rovněž rysy savčích kryptochromů. Savčí kryptochromy jsou převážně jaderné proteiny , ale lze je nalézt i v cytosolu. Stejně jako drozofilní Cry plní savčí kryptochromy při regulaci cirkadiánních hodin jak funkce závislé na světle, tak funkce na světle nezávislé. Úlohu savčích Cry proteinů závislou na světle dokládá několik pozorování. Knokautované myši postrádající jeden nebo oba Cry geny mají sníženou nebo zrušenou schopnost indukovat expresi genů, jako je per a protoonkogen c-fos, v reakci na světlo . Zornice mutantních myší postrádajících Cry1 i Cry2 mají navíc snížené reflexní reakce na světlo .

Na druhé straně vykazuje dvojitá mutantní myš Cry1 Cry2 zdánlivě normální rytmicitu v podmínkách střídání světla a tmy, ale v podmínkách volného běhu (vždy ve tmě) rytmicitu okamžitě a zcela ztrácí . Tato pozorování naznačují, že Cry proteiny hrají zásadní a na světle nezávislou funkci v centrálním cirkadiánním oscilátoru savců a že kryptochromy nejsou jedinými fotoreceptory zprostředkovávajícími světelnou kontrolu hodin. Skutečnost, že kryptochromy jsou nedílnou součástí myšího centrálního oscilátoru, téměř znemožňuje testovat přímo jejich roli v řízení hodin světlem. Nicméně bylo zjištěno, že poněkud analogicky k situaci u drozofily si myší cry mutant zachovává schopnost zprostředkovat světelný vstup, pokud není současně narušena funkce zrakových pigmentů. Trojnásobně mutované myši nesoucí mutace obou kryptochromů spolu s retinálně-degenerativní mutací jsou za podmínek cyklování světla a tmy téměř arytmické . Tyto výsledky ukazují, že savčí Cry proteiny se skutečně podílejí na regulaci cirkadiánních hodin světlem, ale jejich úloha při světelné regulaci cirkadiánních hodin je vykonávána redundantně jinými fotoreceptory. Nyní se zdá být jasné, že dalšími fotoreceptory působícími společně s kryptochromy při entrainmentu savčího cirkadiánního oscilátoru jsou opsiny zrakových tyčinek a příbuzný protein melanopsin .

Stejně jako drozofilní Cry i savčí kryptochromy fyzicky interagují s hodinovými proteiny, včetně promotorově vázaných transkripčních regulátorů Per, Clk a Bmal1 (obr. 3b). Na rozdíl od drozofilních Cry jsou savčí Cry proteiny součástí negativní zpětnovazební smyčky cirkadiánních hodin (obrázek 3b). Fyzická interakce kryptochromu s ostatními složkami hodin ovlivňuje jejich aktivitu, interakci, degradaci nebo jaderný přenos, a následně mění transkripční regulaci hodinových genů . Zdá se však, že interakce mezi kryptochromy a dalšími hodinovými proteiny, jako jsou Per, Clk a Bmal1, nejsou ovlivněny světlem, což naznačuje, že tyto interakce nemusí být mechanismem fotoregulace cirkadiánních hodin, jak je tomu u drozofily. Kromě přímé regulace transkripce prostřednictvím fyzických interakcí s regulátory transkripce vázanými na promotory mohou kryptochromy ovlivňovat cirkadiánní hodiny také tím, že se podílejí na regulaci modifikací histonů , ale způsob, jakým to funguje, je třeba ještě objasnit.

Arabidopsiskryptochromy

Arabidopsis CRY1 a CRY2 jsou převážně jaderné proteiny, které zprostředkovávají regulaci genové exprese a entrainment cirkadiánních hodin v reakci na světlo . CRY1 a CRY2 hrají významnou roli ve fotomorfogenezi rostlin, jako je inhibice prodlužování stonku modrým světlem, stimulace expanze listů modrým světlem a regulace iniciace květu délkou dne . Zdá se, že kryptochromy řídí vývojové změny rostlin prostřednictvím změn genové exprese v reakci na světlo. CRY1 a CRY2 jsou společně zodpovědné za změny exprese genů v závislosti na modrém světle až u 10-20 % genomu Arabidopsis .

Existují nejméně dva mechanismy, kterými mohou kryptochromy ovlivňovat změny exprese jaderných genů v reakci na světlo. Za prvé, molekula kryptochromu může interagovat s proteiny spojenými s transkripčním mechanismem a přímo tak ovlivňovat transkripci. Arabidopsis CRY2 se váže na chromatin způsobem nezávislým na sekvenci DNA ( a M. Maymon a C.L., nepublikovaná pozorování), ale není jasné, jak může protein interagující s chromatinem nezávisle na sekvenci regulovat genovou expresi. Na rozdíl od živočišných kryptochromů, u nichž bylo prokázáno, že regulují transkripci prostřednictvím fyzických interakcí s promotorově vázanými regulátory transkripce, nebyla u rostlinných kryptochromů taková interakce zaznamenána. Alternativním modelem je, že rostlinné kryptochromy mohou interagovat s proteiny vykonávajícími jiné buněčné funkce, aby regulovaly stabilitu, modifikaci a buněčný přenos transkripčních regulátorů. Bylo například zjištěno, že rostlinné kryptochromy interagují s E3 ubikvitin ligázou COP1, což naznačuje, že rostlinné kryptochromy mohou působit způsobem, který dosud nebyl objeven u živočišných kryptochromů . V souladu s tímto názorem bylo také nedávno zjištěno, že kryptochromy Arabidopsis zprostředkovávají modrým světlem potlačení degradace důležitého florálního regulátoru CONSTANS závislého na proteasomu . Jak přesně to kryptochromy dělají, je třeba dále zkoumat.

Mechanismus

Katalytický mechanismus kryptochromů není zcela objasněn, ale určité vodítko lze nalézt v mechanismu fotolýz CPD, kde hlavní katalytickou roli hraje FAD . Při reakci opravy DNA se CPD fotolýza váže na pyrimidinový dimer DNA a „překlápí“ jej z nitra duplexu DNA do dutiny enzymu s přístupem k FAD, čímž vzniká stabilní komplex. Druhý chromofor (pterin nebo deazaflavin), který se také nazývá „anténní“ chromofor, absorbuje fotony modrého nebo UV-A světla a přenáší excitační energii na flavin FAD. Flavin v excitovaném stavu daruje elektron pyrimidinovému dimeru a rozštěpí cyklobutanový kruh. Při tomto procesu je elektron přenesen zpět na flavin, což vede k regeneraci flavinu v základním stavu. Opravený dinukleotid se již nevejde do dutiny s přístupem k FAD, takže se od fotolýzy oddělí. Přesná úloha FAD a dutiny pro přístup k FAD ve funkci kryptochromů zůstává nejasná, ale lze předpokládat, že se může podílet i na reakcích přenosu elektronů.

Ačkoli oblast PHR, která obsahuje chromofor(y), je nejkonzervativnější částí proteinů, bylo prokázáno, že karboxyterminální doména hraje roli ve funkci nebo regulaci živočišných i rostlinných kryptochromů. Exprese karboxy-terminálních domén kryptochromů Arabidopsis fúzovaných s markerovým enzymem b-glukuronidázou propůjčuje konstitutivní růstovou odpověď na světlo i ve tmě při absenci oblasti PHR . Naproti tomu oblasti PHR kryptochromů Drosophily a Xenopuse jsou fyziologicky aktivní v nepřítomnosti karboxykoncové domény . Karboxykoncová doména Cry Drosophily je důležitá pro stabilitu proteinu, interakci s Tim a citlivost fotoreceptoru na cirkadiánní světelné signály , zatímco karboxykoncová doména Cry Xenopusu je nutná pro jeho jadernou lokalizaci .

Kryptochromy jsou regulovány fosforylací. Bylo prokázáno, že kryptochromy Arabidopsis jsou fosforylovány v reakci na modré světlo a že to souvisí s funkcí a regulací fotoreceptorů . Navíc bylo zjištěno, že když byl Arabidopsis CRY1 exprimován v buňkách hmyzu, podléhal autofosforylaci závislé na ATP a na modrém světle . Není známo, zda se živočišné kryptochromy také vážou na ATP, ačkoli bylo prokázáno, že myší kryptochromy jsou fosforylovány .

Interakce mezi PHR oblastí Arabidopsis CRY1 a ATP má několik zajímavých rysů připomínajících interakci mezi pyrimidinovým dimerem a fotolýzou : fosfátové skupiny ATP jsou vystaveny rozpouštědlu; adeninové a ribózové části jsou pohřbeny hluboko v dutině přístupné FAD; a ATP může mít kontakt s FAD zprostředkovaný vodou . Interakce oblasti pHR Arabidopsis CRY1 s ATP také postrádá několik rysů, které se běžně vyskytují u interakcí protein-ATP, jako je interakce protein-fosfát, kontakt protein-Mg2+ a blízký serinový zbytek pro přenos fosfátu . Zkoumání topologie struktury oblasti CRY1 PHR však ukazuje, že všechny tyto vlastnosti by potenciálně mohla zajišťovat karboxyterminální doména kryptochromu (obr. 4). Pozorování, že na serin bohaté karboxy-terminální domény kryptochromů Arabidopsis fúzovaných s β-glukuronidázou jsou konstitutivně fosforylovány in vivo (, naznačuje, že může docházet k fosfotransferu z ATP vázaného v dutině pro přístup k FAD do blízké karboxy-terminální domény (obrázek 4a). Je také možné, že fotony excitovaný FAD může vyvolat přenos elektronů na nukleotid a fosfotransfer z ATP na serinové zbytky na karboxy-terminální doméně. Protože povrch oblasti PHR je převážně záporně nabitý, zejména v místě, kde s ním pravděpodobně interaguje karboxy-terminální doména, fosforylovaná karboxy-terminální doména by pak byla odpuzována od povrchu oblasti PHR, což by vedlo ke změně konformace kryptochromu. Tato konformační změna by umožnila interakci s dalšími signálními proteiny a šíření světelného signálu (obrázek 4a). Alternativně může chybějící vlastnosti potřebné pro produktivní interakci ATP s kryptochromem zajistit také jiná molekula kryptochromu navázaná na dutinu s přístupem k FAD. V Arabidopsis lze skutečně detekovat jak interakci CRY2-CRY2, tak interakci CRY1-CRY2 (D. Shalitin, X. Yu a C.L., nepublikovaná pozorování). Tvorba buď homo-oligomeru, nebo hetero-oligomeru kryptochromů by poskytla mechanismus pro mezimolekulární fosfotransfer, který může změnit strukturu kryptochromů (obr. 4b, c).

.