Kritická role CD29 a CD49f při zprostředkování metastáz u nádorových iniciačních buněk izolovaných z Brca1-asociovaného myšího modelu karcinomu prsu

CSCs v nádorových buňkách Brca1-mutantních myší zprostředkovávají buněčnou migraci in vitro

Předtím jsme izolovali CD24+CD29+ buňky a CD24+CD49f+ buňky, které jsou obohaceny o nádorové iniciační buňky nebo CSCs z primárních nádorů prsu vyvinutých u Brca1-mutantních myší nebo z kultivované buněčné linie, (W0069), která byla odvozena z nádoru prsu s Brca1.39 Abychom otestovali roli těchto buněk v metastazování, vytřídili jsme CD24+CD29+ buňky (budou označovány jako CSC) a CD24-CD29- buňky (non-CSC) z buněčné linie W0069, které obsahují přibližně 15 % CD24+CD29+ buněk, jak bylo uvedeno dříve,39 a zkoumali jsme migrační schopnost pomocí testu hojení ran i transwell testu. Po 24 hodinách vykazovaly CD24/CD29 dvojitě pozitivní buňky lepší migrační schopnost ve srovnání s dvojitě negativními buňkami, jak ukázala velikost rány (obr. 1a). Transwellův migrační test také odhalil významný rozdíl v počtu migrovaných buněk jak na spodním povrchu filtru (175,6±19 vs 54,2±18,1, **P<0,01), tak ve spodní komoře transwellu (82,3±5,5 vs 4,3±2,1 kolonií, **P<0,01) (Obrázek 1b). Podobných výsledků jsme dosáhli, když jsme zkoumali různé subklony odvozené ze stejné buněčné linie, a to buď pozitivní, nebo negativní na přítomnost CSC (údaje nejsou uvedeny). Abychom potvrdili, že CSC mají zvýšenou pohyblivost, smíchali jsme různé množství buněk W0069 s dvojitě negativními buňkami vytříděnými z buněčné linie W0069. Jak ukazuje obrázek 1c, migrační schopnost klesala se snižováním počtu dvojitě pozitivních buněk, ačkoli celkový počet použitých buněk zůstával stabilní při zvyšování počtu CD24-CD29- buněk. Při počátečním použití 5 × 104 buněk W0069 jsme zjistili, že migrující buňky vytvořily 52,6 ± 15,5 kolonií v dolní komoře. Při smíchání 4 × 104 buněk W0069 s 1 × 104 dvojitě negativními buňkami se počet kolonií snížil na 16±2,6. Počet kolonií se dále snižoval, když jsme stále snižovali počet buněk W0069 a zvyšovali počet buněk CD24-CD29- (obrázek 1c). Stejných výsledků bylo dosaženo, když byly buňky W0069 smíchány se subklonem (W0069-202), který má pouze buňky CD24-CD29- (doplňkový obrázek 1a a b). Naopak jsme prokázali, že počet kolonií se zvýšil, když se postupně zvyšoval počet použitých CD24+CD29+ buněk (doplňkový obrázek S1c). K dalšímu ověření úlohy CSC v migraci byly použity buňky značené zeleným fluorescenčním proteinem W0069, pozitivní na přítomnost CSC, a smíchány s vytříděnými neznačenými buňkami CD24-CD29-. Zvýšením počtu pozitivních buněk jsme zaznamenali zvýšení počtu kolonií vytvořených migrujícími buňkami a všechny vytvořené kolonie byly při kontrole pod fluorescenčním mikroskopem zelené, což znamená, že migraci lze pozorovat pouze tehdy, když jsou v buněčné kultuře přítomny CD24+CD29+ buňky (obr. 1d a e). Tyto údaje společně naznačují, že CSC vykazují zvýšenou pohyblivost v nádorových buněčných liniích s mutací Brca1.

CSC u rakoviny s mutací Brca1 zprostředkovávají metastazování rakoviny in vivo

Dále jsme hodnotili potenciální roli CSC v metastazování in vivo. Čerstvě vytříděné CD24+CD29+ a CD24-CD29- buňky a subklony pozitivní nebo negativní pro stejné markery z buněčné linie W0069 byly implantovány do mléčné žlázy 6-8 týdnů starých panenských athymických (nahých) myší. Nejprve jsme zaznamenali, že růst nádoru byl pomalejší, pokud byly tříděné CD24-CD29- buňky porovnávány s buňkami CD24+CD29+ (obr. 2a a b), což je v souladu s představou, že tato populace obohacuje CSC.39 Podobné výsledky byly získány při použití subklonů pozitivních nebo negativních na přítomnost CSC (údaje nejsou uvedeny). Přestože myši injikované buňkami CD24+CD29+ musely být usmrceny dříve (49.-54. den) než myši injikované buňkami CD24-CD29- (60.-69. den) kvůli větší nádorové zátěži, došlo k významnému zvýšení přítomnosti metastáz ve skupině myší injikovaných buňkami CD24+CD29+. Konkrétně 3/15 myší, kterým byly implantovány negativní buněčné linie, mělo v plicích jeden malý nádorový uzlík na myš (obrázek 2c a d). Naproti tomu u 13/18 myší implantovaných pozitivními buněčnými liniemi byly zjištěny metastatické uzlíky v plicích s celkovým počtem více než 100 uzlíků (tento počet může být podhodnocen, protože velikost většiny uzlíků byla mnohem větší a uzlíky nebylo možné přesně spočítat, když jich bylo v jedné plíci příliš mnoho) (obrázek 2c a d). Vzhledem k tomu, že mezi pozitivními a negativními nádory byl přibližně sedminásobný rozdíl ve velikosti primárního nádoru (5000 mm3/700 mm3), zvažovali jsme možnost, že rozdíl v metastázování může být způsoben rozdílem v růstu nádoru. Je však známo, že metastazování nádorů začíná spíše v iniciačních stadiích, kdy jsou nádory malé, než v pozdních stadiích, kdy jsou velké,40 což svědčí proti této možnosti. Kromě toho je rozdíl v počtu uzlin přibližně 33násobný (100/3) a většina uzlin pocházejících z dvojitě pozitivních buněk je mnohem větší než uzliny z dvojitě negativních buněk, což poukazuje na rozdílnou metastatickou schopnost obou subpopulací. Pokud jde o původ tří metastatických uzlíků, je možné, že dvojitě negativní populace může stále obsahovat některé buňky, které mají nižší schopnost iniciovat rakovinu a metastazovat. Případně mohou některé CD24-CD29-buňky získat tyto schopnosti prostřednictvím de-diferenciace. To jsou zajímavé otázky, které si zaslouží další zkoumání.

CD29 a CD49f hrají rozhodující roli při zprostředkování metastazování rakoviny

Zajímavé je, že profilování těchto metastatických nádorů pomocí analýzy třídění buněk aktivovaných fluorescencí s použitím markerů CD24 a CD29 ukázalo, že ty z dvojitě pozitivních buněčných linií mají podobný profil jako primární nádory nebo původní nádorová buněčná linie (obr. 3a, vlevo). Vzhledem k tomu, že pouze CSC uvnitř nádoru mohou rekapitulovat heterogenitu původního nádoru, naznačuje to, že CSC metastazují a řídí vznik metastatických nádorů. Naproti tomu v nádorech odvozených z negativních buněčných linií nebyly zjištěny žádné dvojitě pozitivní buňky CD24 a CD29, a to ani poté, co metastázovaly (obrázek 3a, vpravo), jak odhalila analýza třídění buněk aktivovaná fluorescencí. Dále jsme byli schopni detekovat CD24+CD29+ buňky pomocí imunofluorescenčního barvení v metastatických uzlinách v plicích z nádorů iniciovaných implantací CD24+CD29+ buněk (obrázek 3b), ale ne z nádorů iniciovaných implantací CD24-CD29- buněk (údaje nejsou uvedeny). V souladu s pozorováním, že CD24+CD29+ buňky mají vyšší mobilitu než CD24-CD29- buňky, barvení protilátkami proti CD24 a CD29 také detekovalo CD24+CD29+ buňky v migrujících buňkách během testu hojení ran (obrázek 3c). Tyto výsledky podporují myšlenku, že CSC vykazují zvýšenou pohyblivost jak in vitro, tak in vivo a hrají klíčovou roli v řízení metastatické schopnosti Brca1-mutovaných nádorů prsu.

Jak CD29 (β1 integrin), tak CD49f (α6 integrin) jsou integrinové podjednotky, které slouží jako receptory extracelulární matrix.41 Protože se extracelulární matrix podílí na mobilitě buněk a metastazování rakoviny,41 zajímalo nás, zda CD29 a CD49f slouží pouze jako markery pro CSC, nebo mají skutečně kritickou roli při zprostředkování metastazování rakoviny. Nejprve jsme vyřadili CD29 u buněk W0069 a CD24+CD29+ pomocí individuální malé interferující RNA (siRNA) cílené na otevřený čtecí rámec CD29 a naše data odhalila znatelnou, avšak nikoli statisticky sníženou migraci buněk siCD29 ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 4a a b). Protože CD29 a CD49f tvoří heterodimery, předpokládali jsme, že CD49f by mohl kompenzovat některé funkce, když je exprese CD29 narušena. Abychom to prozkoumali, vyřadili jsme v těchto buňkách CD49f pomocí siRNA (obrázek 4a). Naše údaje ukázaly, že samotné vyřazení CD49f také mírně snížilo schopnost migrace buněk na podobnou úroveň, jaká byla pozorována u buněk ošetřených siCD29 (obrázek 4b). Výrazné snížení migrace buněk, ale nikoli jejich životaschopnosti, však bylo pozorováno při současném vyřazení obou látek (obr. 4a-d). Stejných výsledků bylo dosaženo použitím souboru siRNA proti čtyřem různým oblastem v otevřeném čtecím rámci těchto genů (doplňkový obrázek 2a-c). Ověřili jsme také expresi čtyř příbuzných integrinů (integrinů α5 a 7 a integrinů β2 a 3) po vyřazení CD29 a CD49f a údaje ukazují, že tyto siRNA nezměnily expresi ostatních integrinů, což vylučuje zkříženou inhibiční aktivitu těchto siRNA vůči ostatním integrinům (doplňkový obrázek 2d). Celkově tato zjištění naznačují, že integriny α6 a β1 mohou mít překrývající se, avšak kritickou funkční roli v migraci CSC. Tříděním buněk pomocí integrinů α6 a β1 jako markerů tak vlastně obohacujeme buňky, kde tyto proteiny mohou mít funkční roli při zprostředkování migrace buněk in vitro a metastazování rakoviny in vivo.

CSC vykazovaly genovou expresi signatury přechodu z epitelu do mezenchymu

Pro pochopení mechanismu, který je základem zvýšené metastatické schopnosti CSC, jsme provedli morfologické a molekulární analýzy jak CD24+CD29+, tak CD24-CD29- buněk. Naše analýza ukázala, že buňky CD24-CD29- vykazovaly výraznější membránovou vazbu E-cadherinu, markeru epiteliálních buněk, než buňky CD24+CD29+ (obr. 4e). qRT-PCR analýza rovněž zjistila vyšší hladiny exprese E-cadherinu u buněk CD24-CD29- než u buněk CD24+CD29+ (obr. 4f). V souladu se sníženými hladinami exprese E-cadherinu vykazovaly buňky CD24+CD29+ také vyšší hladiny exprese několika markerových genů pro mezenchymální buňky, jak bylo zjištěno pomocí qRT-PCR (obrázek 4f) a analýzy Western blot (doplňkový obrázek 2e). Vzhledem k tomu, že oba typy buněk byly odvozeny z karcinomu mléčné žlázy, zvýšený mezenchymální rys CD24+CD29+ buněk naznačuje, že prošly přechodem z epitelu na mezenchym, což poskytuje molekulární základ pro jejich zvýšenou pohyblivost in vitro a metastazování rakoviny in vivo.

Shrnem jsme studovali metastatický potenciál CSC obohacených o populaci CD24+CD29+ buněk izolovaných z myšího modelu karcinomu prsu s mutací Brca1 a naše údaje naznačily, že CSC vykazovaly mnohem vyšší migrační schopnost než non-CSC v tkáňové kultuře a zvýšený metastatický potenciál u alograftů na myších. Prokázali jsme, že CD24+CD29+ buňky si zachovaly schopnost diferenciace a obnovení heterogenity v metastatických nádorech, zatímco CD24-CD29- buňky nikoli. Nejzajímavějším zjištěním však je, že CD29 a CD49f, které byly použity jako markery pro izolaci CSC z myších mamárních nádorů,39, 42, 43 mají překrývající se, avšak kritickou roli při zprostředkování migrace CSC. U myší představuje β1-integrin převážně exprimovaný integrin v epiteliálních buňkách mléčné žlázy a má kritickou roli v progresi rakoviny.44 Zatímco u lidských karcinomů prsu je α6-integrin exprimován ve vysoké míře a slouží jako nezávislý prognostický faktor, jak odhalila studie s časově závislým účinkem omezeným na první 2 roky sledování.45 Přesto zůstává potenciální role obou genů v CSCs karcinomů prsu neobjasněna. Naše údaje ukázaly, že zhoršená funkce samotného integrinu β1 nebo integrinu α6 vede k mnohem mírnějšímu účinku než vyřazení obou genů současně. Toto zjištění je v souladu se skutečností, že oba integríny se mohou navzájem párovat a vytvářet heterodimery pro složky extracelulární matrix, jako je fibronektin a laminin.41, 46, 47, 48, 49 Bylo navrženo, že maligní sociální síť zprostředkovává adhezi buněk a komunikaci mezi CSC a jejich mikroprostředím.20, 21 Naše studie naznačuje důležitou roli β1/α6 integrinů při zprostředkování této sítě. Konkrétně mohou β1/α6 integráty zprostředkovávat interakci CSCs-stroma, přenášet signály z extracelulární matrix do buněčných mechanismů a vést ke zvýšené aktivitě CSCs, pokud jde o životaschopnost, diferenciaci a metastazování.