Popisuje se zde, jak nastavit a provést kolorimetrický test pro stanovení koncentrace látky, která je v roztoku.
Obecný přístup
Nemůžeme dát materiál pod mikroskop a spočítat počet molekul na jednotku objemu tak, jako můžeme spočítat počet buněk na jednotku objemu. Musíme najít něco, co můžeme měřit a co je úměrné koncentraci látky, která nás zajímá. Měřením, které se v testech nejčastěji používá, je absorbance světla. Beerův zákon nám říká, že pokud rozpuštěná látka absorbuje světlo určité vlnové délky, je absorbance přímo úměrná koncentraci látky v roztoku. K měření a zobrazení a/nebo záznamu absorbance v kvantifikovatelných jednotkách se používá přístroj zvaný spektrofotometr. Látka sama o sobě často neabsorbuje světlo tak, aby bylo možné provést praktický test. Možná budeme muset použít jedno nebo více činidel k vytvoření barevných sloučenin v poměru ke koncentraci neznámé látky.
Měření absorbance světla vzorkem nám řekne jen velmi málo, pokud nemáme k dispozici standard pro srovnání. Pokud například vzorek X vykazuje absorbanci 0,5, jaká je skutečná koncentrace X? Pokud máme vzorek o známé koncentraci a tento vzorek také vykazuje absorbanci 0,5, pak máme dostatečnou jistotu, že látka má stejnou koncentraci. Předpokládejme, že máte několik vzorků a jejich koncentrace se liší. Bylo by užitečné mít řadu standardů, které pokrývají celý rozsah pravděpodobných koncentrací naší neznámé. K tomu slouží standardní křivka. Připravíme sérii standardů o známé koncentraci X v rozsahu od nízké po vysokou koncentraci. Provedeme analýzu a vykreslíme graf závislosti absorbance na koncentraci pro každý standard. Pomocí této standardní křivky můžeme odečíst koncentraci neznámé vzhledem k údaji o její absorbanci.
Kontroly
Při provádění analýzy musíme zajistit, aby za absorbanci světla v zájmovém rozsahu vlnových délek byla odpovědná pouze látka, kterou analyzujeme. Všechny podmínky, za kterých se připravují standardy a neznámé látky, by měly být identické. Pokud rozpuštěné látky v pufrech vzorků ovlivňují absorbanci, máme problém. Přesné výsledky nezískáme, pokud budeme měnit objemy, ve kterých připravujeme a analyzujeme standardy a neznámé. Čas odečtu absorbance, teplota, při které uchováváme materiály, a všechny ostatní fyzikální faktory by měly zůstat stejné. Protože není vždy praktické použít identické pufry pro všechny neznámé a standardy, musíme pouze zajistit, aby žádná ze složek některého z pufrů neměla významný vliv na absorbanci.
Pokud použijeme stejný objem pro všechny standardy a neznámé, značně zjednodušíme analýzu. Standardní křivka může místo koncentrace vykreslovat závislost absorbance na množství látky. Při provádění analýzy může být méně matoucí pracovat s množstvím, zejména pokud je nutné ředění. Pokud znáte původní objem vzorku, který byl při analýze použit, je stanovení koncentrace snadné.
Kompenzace
Všechny testy mají své limity. Množství látky pod určitým minimem bude nedetekovatelné. Nad určitým maximálním množstvím nebo koncentrací se analýza stává nasycenou, to znamená, že zvýšení množství nebo koncentrace nemá vliv na absorbanci. Obecně se snažíme pracovat v lineárním rozsahu zkoušky, tj. tam, kde je absorbance přímo úměrná koncentraci. V ideálním případě bychom měli nastavit standardy, které zahrnují celý užitečný rozsah zkoušky. To znamená, že optimalizujeme rozsah zkoušky.
Často je vzorek tak koncentrovaný, že při stanovení předepsaného objemu vzorku je výsledek mimo stupnici – stanovovací činidlo je nasycené. Řešením je pak vzorek naředit. Pokud je například objem každého standardu nebo vzorku 1 ml a 1 ml vaší neznámé dává výsledek mimo stupnici, můžete do zkumavky přidat 0,1 ml vzorku spolu s 0,9 ml pufru. Pokud odečtete koncentraci ze standardní křivky, pak výsledek vynásobte 10, abyste získali skutečnou koncentraci ve vzorku. Pokud odečtete množství ze standardní křivky, pak toto množství jednoduše vydělte 0,1 ml, abyste získali svou koncentraci.
Pokud jsou vzorky tak koncentrované, že nemůžete přesně odpipetovat dostatečně malé množství, možná budete muset provést sériové ředění.
Příklad: Příprava standardní křivky
Nastavíme hypotetický test pro měření látky X. Po smíchání látky X s testovacím činidlem vznikne komplex, který absorbuje světlo o vlnové délce 400 nm. Náš spektrofotometr vyžaduje, abychom do každé kyvety vložili 2 ml objemu. Kyveta je průhledná nádobka, která se umístí do dráhy světla pro měření absorbance. Abychom získali správný poměr testovacího činidla a vzorku, připravíme si objem vzorku 0,5 ml a do každé zkumavky přidáme 1,5 ml barevného činidla. Takto nastavená zkouška může detekovat množství látky X od pouhých 10 mikrogramů (µg) až po 2 miligramy (mg).
Referenční
Pro kalibraci spektrofotometru potřebujeme referenční zkumavku, která je ve všech ohledech identická se standardy a vzorky, až na to, že neobsahuje žádnou látku X. Se zablokovanou světelnou cestou bude spektrofotometr nastaven na odečet nekonečné absorbance (vůbec nepropouští světlo). S referenční trubicí v cestě světla nastavíme spektrofotometr tak, aby odečítal nulovou absorbanci. Tímto způsobem bude vzorek obsahující X vykazovat absorbanci v tomto rozsahu. Referenční trubice se používá proto, aby nám poskytla maximální dynamický rozsah.
Pro tento hypotetický příklad bude referenční trubice obsahovat 0,5 ml pufru pro vzorek a 1,5 ml barevného činidla.
Standardy
Tento příklad popisuje hypotetickou analýzu pouze pro ilustraci.
Chceme co nejlepší přesnost, které můžeme dosáhnout, a náš rozsah zahrnuje dva řády, takže jedním ze způsobů nastavení standardní křivky je logaritmický postup standardů. Potřebujeme standardy od 0,01 mg do 2 mg. Zkusíme množství 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1 a 2 mg. Poslední mezera je poměrně široká, takže přihoďme jeden standard, řekněme 1,5 mg. Při přípravě standardů je vhodné začít s koncentrovaným základním roztokem látky. Největší množství, které potřebujeme, jsou 2 mg v objemu 0,5 ml. Abychom měli trochu „manévrovacího prostoru“, připravme zásobní roztok látky X o koncentraci 5 mg/ml. Následující tabulka uvádí výpočty.
Tabulka 1. Příklad plánování standardní křivky. Koncentrace bílkoviny v zásobním roztoku byla 5 mg/ml. Tento příklad slouží pouze pro ilustraci.
| množství látky X (mg) | objem základního roztoku (µl) | objem pufru (µl) |
|
0 (referenční) |
0 | 500 |
| 0.01 | 2 | 498* |
| 0.02 | 4 | 496* |
| 0.05 | 490 | |
| 0.1 | 20 | 480 |
| 0.2 | 40 | 460 |
| 0.5 | 100 | 400 |
| 1 | 200 | 300 |
| 1.5 | 300 | 200 |
| 2 | 400 | 100 |
*Běžně se používají pipetory, které nám udávají objemy s přesností nejvýše na 2 platné číslice.
Objem pufru není tak kritický jako objem zásobního roztoku. Chyby v pipetování pufru ovlivňují celkový objem, a tím i koncentraci barevného činidla. Chyby menší než 1 % nemají na výsledky významný vliv. Ve skutečnosti, pokud objem barevného činidla značně převyšuje objem vzorku (ne v tomto případě), bychom ani nemuseli vyrovnávat objemy přidáním pufru.
Některé laboratoře nejsou vybaveny pipetory, které jdou s přesností pod 5 µl. Může být nutné provést sériové ředění, aby se do zkumavky dostaly například 2 nebo 4 µl zásobního roztoku.
Příprava vzorku
Pomáhá mít rozumný odhad rozmezí koncentrací vzorku, které lze očekávat. I s takovým odhadem je dobré připravit vzorky s rozsahem ředění pro případ, že je vzorek natolik koncentrovaný, že jeho hodnoty absorbance jsou mimo rozsah.
Při zkoušce v příkladu, pokud použijeme 500 µl vzorku ve zkumavce (maximální objem), by jeho koncentrace musela být menší než 4 mg/ml, aby byla absorbance čitelná. Tolik bychom naopak chtěli, kdyby byl vzorek řekněme desetkrát méně koncentrovaný. Protože nevíme nic o koncentraci konkrétního vzorku, naplnili bychom jednu zkumavku 500 µl, abychom pokryli tento rozsah. Protože test pokrývá široký rozsah koncentrací, můžeme použít 50 µl ve druhé zkumavce. Nyní může být vzorek koncentrovaný až 40 mg/ml a ve zkumavce budeme mít stále 4 mg nebo méně, což nám poskytne čitelný výsledek. Abychom pokryli všechny základny, můžeme provést analýzu ve třetí zkumavce s pouhými 5 µl vzorku.
Spustit analýzu
Když jsou všechny standardy a neznámé připraveny, budeme mít:
- 1 referenční zkumavku
- nějaký počet standardů, které pokrývají celý rozsah zkoušky
- dvě nebo tři zkumavky pro každý vzorek představující sérii ředění
Je čas provést postup pro vyvolání barvy, který může být tak jednoduchý jako přidání barevného činidla a ponechání vzorků několik minut. Pokud je to praktické, mělo by být zpracování každého standardu a vzorku načasováno tak, aby se absorbance odečítala po stejném časovém intervalu pro každou zkumavku. Přístroj by se měl zkalibrovat a poté by se měly odečíst absorbance pro každou zkumavku v pořadí. Standardní křivka se získá vynesením grafu závislosti absorbance na množství látky X. Pokud je vztah jasně lineární, není standardní křivka ani nutná. Množství lze určit pomocí interpolace. Křivka by měla být sestrojena při prvním použití testu, aby se ověřila přesnost a linearita.
Příklad standardní křivky
Takto může vypadat graf v laboratorním sešitě (student má zřejmě vynikající rukopis). Vztah není dokonale lineární, spíše vykazuje typický extinkční vzorec.
Protože je rozsah tak široký, u vzorků dávajících velmi nízké hodnoty absorbance by student mohl chtít druhý graf s vyšším rozlišením.
Určete koncentraci vzorku
Koncentrace je množství něčeho na jednotku objemu. Obvykle uvádíme koncentrace bílkovin v miligramech na mililitr(mg/ml), i když je někdy vhodné používat mikrogramy/mikrolitr (µg/µl) nebo třeba i µg/ml (pro velmi malé koncentrace). Pro neznámou vydělíme množství látky (ze standardní křivky) objemem vzorku použitého v testu. Všimněte si, že tento objem není objemem analýzy ani objemem zředěného vzorku. Vydělte objemem neředěného vzorku, který jste vložili do zkumavky pro analýzu.
Předpokládejme, že jste připravili tři zkumavky pro analýzu vzorku č. 1, které obsahují 500 µl, 50 µl a 5 µl vzorku. Předpokládejme, že v nich byly naměřeny hodnoty absorbance 0,86, 0,12, resp. 0,01. Poslední absorbance je samozřejmě mimo stupnici. Intercepce by měla být nulová, ale nemůžeme počítat s tím, že velmi nízké absorbance nám poskytnou dostatečně přesné údaje.\
Absorbance 0,86 odpovídá 1,7 mg látky X. Objem byl 500 µl (0,5 ml), takže dostaneme koncentraci 3,4 mg/ml. To zní dobře. Při kontrole druhé čitelné zkumavky absorbance 0,12 znamená, že zkumavka obsahovala 0,20 mg látky X. Objem byl 50 µl (0,050 ml). Koncentrace by měla být 0,20 mg/0,050 ml = 4,0 mg/ml. Který výsledek použijeme, nebo vezmeme průměr?“
Zjistil jsem, že použití jednoho údaje absorbance, který se nejvíce blíží středu citlivého rozsahu, dává nejpřesnější výsledky. Ve výše uvedeném příkladu je středem asorbance 0,5, což odpovídá 0,1 mg látky. Stupnice absorbance je logaritmická, takže i z digitálního displeje jsou spolehlivější údaje na dolním konci stupnice. Při velmi nízkých absorbancích však bude mít jeden nebo více neznámých faktorů, například vada ve zkumavce nebo kyvetě, na hodnotu absorbance větší vliv než při vyšších absorbancích. Na horním konci rozsahu se barevné činidlo blíží nasycení, takže nejenže máte menší rozlišení mezi odečty absorbance, ale činidlo je méně citlivé na rozdíly v koncentraci bílkovin.