Klonogenní test byl použit v mnoha studiích ke kvantifikaci klonogenního růstu a jeho zrušení cytotoxickými stimuly, včetně záření, chemoterapeutik a/nebo molekulárně cílených látek, in vitro. Současný standardní postup pro stanovení frakcí přežití je založen na předpokladu, že klonogenní růst v ošetřených buněčných kulturách lze normalizovat na neošetřené kontroly prostřednictvím dělení konstantním PE specifickým pro buněčnou linii.
Nyní však ukazujeme, že to není univerzálně použitelné. Naše údaje naopak jasně ukazují, že korelace mezi počtem buněk nasazených do kultivační misky a počtem získaných kolonií není zdaleka vždy lineární. U buněčných linií s kooperativním chováním poskytla analýza údajů o klonogenním přežívání založená na PE výsledky s velkými až enormními chybami vlastními testu. I když byly pro analýzu použity pouze kultivační misky s přiměřeným počtem kolonií (C = 5 až 100), lišily se frakce klonogenního přežívání při dané dávce u buněčných linií s vysokým stupněm buněčné spolupráce o více než jeden řád. Za zmínku stojí, že z tohoto rozsahu výsledků vypočtených z daného souboru dat lze odvodit prakticky jakoukoli křivku přežití (strmou nebo plochou, mírně nebo silně zakřivenou, lineární, kvadratickou nebo nepravidelnou) – což je pozorování, které může mít zvláštní význam pro radiační biology.
Souhrnně naše údaje ukazují, že konvenční analýza údajů o klonogenním přežití založená na PE funguje nevhodně, jakmile dojde k buněčné spolupráci za jedné nebo více podmínek v rámci experimentu, a získané výsledky přežití se budou lišit v neuspokojivě velkém rozsahu. Konkrétně budou výsledky silně zkreslené, pokud je nasazena pouze jedna nebo několik málo podobných hustot buněk. Tento postup vytváří vnitřní chyby testu, které jsou přímým důsledkem zvolené hustoty buněk, a proto je nelze podrobit statistické analýze chyb. U kooperativně pěstovaných buněčných linií mohou naše pozorování částečně vysvětlit hlášené neshody údajů o reakci na léčbu mezi jednotlivými testy, výzkumníky a laboratořemi. Tuto hypotézu dále podporuje metaanalýza údajů z testu tvorby kolonií A549: Nuryadi et al. v rámci panelu 156 různých studií uvedli hodnoty SF4 pro tuto specifickou buněčnou linii v rozmezí od 5 do 90 % s mezikvartilovým rozsahem SF4 více než 25 % . Ačkoli údaje o odpovědi na léčbu mohou jistě ovlivňovat různé další parametry, z našich údajů vyvozujeme, že hlavním faktorem vysvětlujícím variabilitu mezi studiemi je buněčná spolupráce. Vzhledem k tomu, že i malé rozdíly ve frakcích klonogenního přežití mohou podnítit výzkumné pracovníky k postulování a studiu nových vědeckých hypotéz, které by nakonec mohly být založeny na falešné přesnosti, vyvinuli jsme nový přístup k analýze, který je méně náchylný k vlivu buněčné hustoty – zejména, ale nejen pro kooperativně rostoucí buněčné linie. Tato metoda zohledňuje nelineární vztahy mezi počtem nasazených buněk a počtem kolonií získaných bodováním kultivačních misek s širokým rozsahem počtu nasazených buněk pro všechny podmínky ošetření.
Matematicky náš přístup využívá mocninnou regresi a interpolaci odpovídajících počtů kolonií při různých dávkách ozáření. Při aplikaci na stejný soubor dat, který byl použit pro výpočty založené na PE, poskytl jednoznačně stabilnější výsledky nezávislé na hustotě buněk. Pozorní čtenáři si možná všimli, že výpočty podílu přežití prováděné podle zde prezentované metody se opírají pouze o koeficient a a exponent b extrahovaný pomocí výkonové regrese. Ačkoli to samozřejmě kompenzuje účinky buněčné spolupráce, nese to další kvalitu chyby, která vyplývá z nepřesnosti regrese a kterou nelze kvantitativně srovnávat s podobnou kvalitou chyby ve výpočtech podílu přežití na základě PE. Proto by tato chyba měla být minimalizována zajištěním pečlivého návrhu experimentu s dostatečným počtem nezávislých replikátů. Kromě toho by výpočty frakce přežití měly být prováděny pouze s výsledky výkonové regrese s náležitým výkonem, jak ukazuje regresní koeficient R.
Náš matematický přístup v podstatě nahrazuje výpočty klonogenního přežití založené na PE otázkou:
Kolikrát více buněk je třeba nasadit do ošetřené kultivační misky, aby se získal stejný počet kolonií jako v kontrolní misce?
V tomto ohledu je zvláště důležitý exponent b . Udává, zda je korelace mezi počtem nasazených buněk a počtem spočítaných kolonií lineární (b ≈ 1), nebo ne. Vysoké hodnoty b, jakých bylo dosaženo u buněk BT20 a SKLU1, naznačují, že růst buněk in vitro se zpomalí (nebo zcela zruší), pokud se zvýší objem kultivačního média na buňku – buď použitím velkých testovacích objemů, nebo snížením počtu nasazených buněk. Je třeba zdůraznit, že hodnoty b nejsou v žádném případě specifické pro určitou buněčnou linii, ale jsou spíše důsledkem zvoleného kultivačního média, několika parametrů inkubace testu a experimentálního postupu zahrnujícího prakticky jakýkoli aspekt, který by mohl ovlivnit klonální růst buněk, které jsou v extrémní stresové situaci, když jsou nasazeny jako jednotlivé buňky, jako je složení média, doplňování živin a růstových faktorů, metody použité pro separaci buněk, plastové nádobí atd. Například použití kondicionovaného média z téměř konfluentních buněk BT20 silně oslabilo kooperativní chování jednotlivých buněk BT20, zatímco tento postup neměl žádný vliv na klonogenní růst nekooperativně rostoucích buněk MDA-MB231. Kromě toho byla doba zdvojení kooperativních buněk BT20 závislá jak na době inkubace testu, tak na hustotě buněk v jamce, což poskytuje zřejmé biologické vysvětlení nepřesných frakcí klonogenního přežití získaných výpočty na základě PE: Rychlost růstu proliferujícího shluku buněk může být jednoduše příliš pomalá na to, aby dosáhla prahové hodnoty 50 buněk na kolonii během inkubační doby testu. Proto je zdánlivá „neklonálnost“ shluku např. 35 pomalu proliferujících buněk v bodě zastavení pouze nevyhnutelným důsledkem inkubační doby testu, která je – alespoň do určité míry – zvolena libovolně. V této souvislosti jsme dodatečně analyzovali vliv inkubační doby na získané podíly klonogenního přežívání a zjistili jsme, že nestačí určit časový bod zastavení pouze kontrolou kontrolních misek, jak navrhují jiní : Předčasné ukončení inkubační doby může vést k mimořádně nízkým podílům přežívání na destičkách s agresivnějším ošetřením, kde oprava poškození před pokračováním růstu buněk vyžaduje další čas.
Důležité je, že naše údaje jsou plně v souladu se zásadními zjištěními průkopnických výzkumníků buněčných kultur ve 40. a 50. letech 20. století a jednoduše odrážejí jev, který byl v té době předmětem rozsáhlého zkoumání. Puck a jeho kolegové jako první publikovali v roce 1956 křivku přežívání ozářených jednotlivých buněk. Největší vědeckou výzvou pro tento zásadní úspěch však byl v té době nevyřešený problém savčích buněčných kultur: Buněčné linie přestaly růst in vitro, jakmile byly buňky rozmístěny v nízké hustotě. Pokus o překonání tohoto problému učinili v roce 1948 Sanford a spol. a podařilo se jim vypěstovat kolonie fibroblastů odvozených z jedné buňky v malých kapilárách, kde byla silně omezena difuze faktorů odvozených z buněk do média, což umožnilo dostatečnou autokrinní stimulaci růstu . Zjistili význam předúpravy kultivačního média kultivovanými buňkami a dospěli k závěru, že kultivační médium postačující k umožnění nekonečného růstu buněčné kultury o vysoké hustotě je ve skutečnosti „daleko od optimálního pro růst jedné buňky“. V souladu s tím Earle a kol. popsali, že množení příslušného typu buněk při velmi nízké hustotě vede k buněčné smrti , a tato práce se stala základem pro první publikaci o klonogenním růstu savčích buněk in vitro, kterou v roce 1955 publikovali Puck a Marcus. Inspirováni potřebou kondicionovaného kultivačního média pro usnadnění růstu jednotlivých buněk použili systém společné kultivace jednotlivých buněk HeLa a vrstvy silně ozářených napájecích buněk stejného typu. Ve shodě s předchozími studiemi dospěli k závěru, že inhibice růstu jednotlivých buněk ve velkých testovacích objemech je způsobena „ztrátou krátkodobého, difúzního faktoru“ . V pozdějších publikacích, například v té s první křivkou přežití ozářených savčích buněk, Puck a jeho kolegové často vynechávali použití napájecích vrstev, protože vyvinuli pokročilé kultivační techniky umožňující růst jedné buňky se 100% PE bez doplňování růstového faktoru napájecími buňkami . Uvedli, že v tomto ohledu jsou zásadní pečlivé protokoly promývání a trypsinizace, a zavedli termín „kooperativní působení“, který popisuje, že buňky v kultivační misce se mohou lišit s ohledem na genotyp i fyziologický stav . Naše zjištění tato pozorování rekapitulují: V rámci panelu 50 nádorových buněčných linií jsme zjistili, že suboptimální růst jednotlivých buněk v moderních standardizovaných kultivačních médiích doplněných FCS je stále velmi častým jevem, jak lze odvodit ze zjištění, že více než polovina buněčných linií vykazovala kooperativní růstové chování. Pokud jsou tedy u určité buněčné linie zjištěny suboptimální PE, je pravděpodobné, že klonogenní test současně odhalí jak vliv zájmového ošetření, tak vliv buněčné spolupráce. V rámci této studie nebylo možné identifikovat specifické faktory podporující růst, které by mohly ovlivnit PE analyzovaných buněčných linií. Předpokládáme však, že suboptimální růstové podmínky pro jednotlivé buňky dané buněčné linie mohou být důsledkem velmi různých parametrů, jako jsou nízké koncentrace klasických růstových faktorů a/nebo hormonů (např. epidermálního růstového faktoru nebo estrogenu), ale také různých nízko- a vysokomolekulárních metabolitů, pro které alespoň část jednotlivých buněk vykazuje auxotrofii. Kromě toho bude doplňování živin jednotlivými buňkami v kultivační misce pravděpodobně ovlivněno fyzikálně-chemickými parametry okolního média a plastového nádobí, včetně stupně vazby proteinů příslušných auxotrofních faktorů nebo jejich adsorpce na povrch plastu. Teoreticky by se tento problém mohl řešit přijetím opatření, která obnoví maximální PE v podmínkách nízké hustoty tak, aby se (znovu) vytvořila lineární korelace mezi S a C (b = 1). Puckova doporučení pro použití podávacích buněk, kondicionovaných médií a/nebo vložení jednotlivých buněk do měkkého agaru mohou být pro dosažení tohoto cíle u vybraných buněčných linií dostatečná a měla by odpovídajícím způsobem zvýšit robustnost výpočtů založených na PE. Je však zřejmé, že může být více než náročné upřesnit a standardizovat podmínky testu tak, aby míra přežití a růstu jednotlivých buněk byla optimální pro každý jednotlivý typ buněk, který je předmětem zájmu . Rozhodli jsme se akceptovat suboptimální podmínky testu pro růst jednotlivých buněk a místo toho jsme vyvinuli výpočetní metodu pro analýzu údajů o klonogenním přežívání, která tento dobře popsaný jev zohledňuje. Je zřejmé, že náš přístup využívající mocninnou regresi a interpolaci přesahoval technické možnosti padesátých let, kdy se údaje o přežití upravovaly od oka . V následujících desetiletích se však význam buněčné spolupráce nějak přesunul do pozadí. Ačkoli se v průběhu času objevilo několik zpráv o nelinearitě v testech tvorby kolonií, omezeným výkonem analýz založených na PE se nikdo nezabýval .
Zajímavé je, že tyto studie uváděly méně než lineární nárůst počtu kolonií s rostoucím počtem nasazených buněk pro určité typy buněk za specifických podmínek. V souladu s tím jsme pro několik buněčných linií v našem panelu také získali hodnoty b mírně pod 1,0. Toto pozorování lze vysvětlit třemi různými scénáři, z nichž dva jsou způsobeny metodickými artefakty: Za prvé, hodnoty b mírně pod 1,0 mohou být důsledkem počítání jamek s velkým počtem přerostlých kolonií, kde výzkumník malé kolonie přehlédl (viz jamky označené „nd“ na obr. 1a). Za druhé, růst buněk v miskách s vysokým počtem buněk může být v poměrně raných fázích inhibován v důsledku rychlého poklesu koncentrace živin, což vede k abortivním koloniím. Třetí – a biologicky méně intuitivní – možností je kompetitivní chování buněčného růstu, například v důsledku sekrece růst inhibujících faktorů. Důležité je, že každý z těchto jevů je zohledněn regresním a interpolačním přístupem, protože zohledňuje jakoukoli odchylku od linearity, která se odráží v hodnotě b.
Navíc je pozoruhodné, že hodnoty b různých buněčných linií pro neošetřené podmínky ve srovnání s ozařovanými nejsou totožné. Ve většině těchto případů mají hodnoty b ozářených buněk tendenci být vyšší než příslušné hodnoty b neošetřených kontrol, což naznačuje, že se při ozáření zvyšuje buněčná spolupráce. V důsledku toho se rozsah hodnot frakce přežití získaných pro C = 5 až 100 kolonií stává širším než v případě téměř identických hodnot b (viz buněčné linie HCC1806 a A549). To znamená, že technicky není možné získat přesnější hodnoty přežití pomocí postupu klonogenního testu – pokud nebyl pro analýzu vybrán jeden pevný počet kolonií (C). Kromě toho mohou být buněčné linie s mimořádně vysokými hodnotami b pro ošetřené buňky zvláště zajímavé s ohledem na studie rezistence k terapii. Například faktor(y) přežití vyvolaný(é) zářením vylučovaný(é) určitým typem buněk by mohl(y) být identifikován(y) díky odpovídající vysoké hodnotě b.
Shrnem naše údaje ukazují, že je třeba pečlivě analyzovat údaje z experimentů s tvorbou kolonií a zvážit podceněný vliv buněčné spolupráce na výpočty frakce přežití. To může výrazně zvýšit spolehlivost klonogenního testu – a odolnost jakékoli hypotézy na něm založené.