Klinický, genetický a strukturální základ zjevného nadbytku mineralokortikoidů v důsledku deficitu 11β-hydroxysteroid dehydrogenázy typu 2

Výsledky

Popisujeme demografické údaje a klinický fenotyp 36 geneticky potvrzených pacientů s AME z Mezinárodního konsorcia vzácných steroidních poruch. Většina pacientů byla ománského (22 z 36) a perského (6 z 36) původu, přičemž 75 % pocházelo z příbuzenských manželství, především v rámci Ománu (obr. 1B a tab. S1). Medián věku při stanovení diagnózy AME byl 4,6 roku (rozmezí: 0,1-15) a kohorta byla rovnoměrně rozložena pro obě pohlaví. Většina pacientů (86 %) se narodila v termínu, přičemž 76 % se narodilo v malém gestačním věku. Obr. 1A ukazuje, že v naší kohortě se vyskytlo šest missense, jedna inserční, dvě deleční a tři frameshift mutace a dva indely. Podle očekávání patofyziologie AME byl přítomný střední arteriální tlak u všech subjektů zvýšen nad 90. percentil (obr. 1C). Průměrná hladina sérového draslíku při stanovení diagnózy byla nízká – 2,72 mmol/l (rozmezí: 1,5-4,1 mmol/l), zatímco sérový bikarbonát byl vysoký – 29,5 mmol/l (rozmezí: 20-38 mmol/l) (obr. 1 D a E). Sérové hladiny aldosteronu byly očekávaně nízké (obr. 1F), u dvou pacientů byly z nejasných důvodů zvýšené. Kromě toho byly nízké i hladiny reninu, s výjimkou dvou pacientů (10,4 a 14 ng/ml/h), kteří byli na terapii (tab. S1). V podskupině 29 pacientů byl průměrný poměr (THF + aloTHF)/THE, představující hlavní močové metabolity kortizolu a kortizonu, významně zvýšen u 19 (rozmezí: 3-55, norma: 1,0) (obr. 1G). Za zmínku stojí, že u 27 z 36 (75 %) pacientů byla přítomna také nefrokalcinóza. Nefrokalcinóza může vznikat v důsledku chronické dlouhodobé hypokalémie, jak bylo zaznamenáno například u Bartterova syndromu typu III (14).

Abychom pochopili, zda lze klinický fenotyp deficitu HSD11B2 předpovědět zkoumáním změn ve struktuře enzymu vyvolaných danou mutací HSD11B2, provedli jsme in silico analýzy s použitím tří estrogenních HSD17B1, které vykazovaly 27% sekvenční podobnost s HSD11B2 na 284 aminokyselinách (obr. S1A). Model lidské HSD11B2 vykazoval charakteristický konzervovaný motiv Rossmannova záhybu vázajícího NAD (obr. S1B) s přilehlým substrátovým vazebným místem (obr. S1 C a D). MD simulace 500 ns monomerní a dimerní formy HSD11B2 ukázaly stabilní model se stabilně složeným proteinem (obr. S1 E-H). Ke stanovení ΔΔG missense mutací nalezených u pacientů s AME nebo experimentálně vytvořených mutací jsme použili software Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18). U všech mutací (obr. 2A) došlo ke zvýšení hodnot ΔΔG, což naznačuje ztrátu stability a funkce proteinu (obr. 2B).

HSD11B2 existuje v neaktivním stavu jako homodimer (13). Čtyři zbytky – jmenovitě R186, E190, A237 a R336 – leží na rozhraní dimeru, a mohly by proto bránit tvorbě dimeru (obr. 2C). Rezidua R186 a E190 jsou umístěna na rozhraní dimerů na šroubovici α4. Interakce iontového páru mezi podjednotkami (R186-E190) vzniká v důsledku dvojnásobné obrácené symetrie sousední podjednotky (obr. 2D), podobně jako iontový pár R112-E120 v HSD17B1 (15⇓-17). Důležité je, že tato interakce se ukázala jako stabilní a byla zachována v průběhu 500ns MD simulací (obr. 2 E-G). Dále bylo zjištěno, že interakce stabilizuje šroubovici α4 a udržuje flexibilitu kolem vazebného místa pro koenzym. Mutace R186C tedy vede ke ztrátě mezisubstitučního iontového páru a posouvá rovnováhu směrem k tvorbě aktivního monomerního enzymu (obr. 2H). Zabraňuje také vzniku intrahelikální interakce iontového páru a umožňuje tak destabilizaci strukturních prvků v okolí vazebného místa pro koenzym.

Na tomto dimerním rozhraní existuje několik dalších rušivých mutací zahrnujících zbytky A237, D244, L251 a D176. Zbytek A237 je obklopen L241 a V239 z obou podjednotek HSD11B2. Jeho mutace na Val zvyšuje hydrofobicitu tohoto shluku a posiluje neaktivní dimerní stav enzymu (obr. 2I). Zbytek D244 vytváří nejen vnitrosubjednotkový solný můstek s R336, který drží pohromadě šroubovici α5 a listy β7, ale také interakce vodíkové vazby s R360 ze sousední podjednotky (obr. 2J). Jeho mutace na Asn snižuje sílu interakce s R360, což vede ke ztrátě solného můstku s R366; to zase zhoršuje stabilitu proteinu. Podobně mutace hydrofobního postranního řetězce L251 na hydroxylovou skupinu Ser zvyšuje polaritu a vytváří vodíkovou vazbu s kladně nabitými skupinami postranního řetězce R361; to zvyšuje vazbu dimeru (obr. 2K). A konečně mutace D176 na Asn vytváří vodíkovou vazbu mezi asparaginem a T200, čímž posiluje neaktivní stav dimeru (obr. 2L).

Mutace zbytků HSD11B2, které tvoří substrátovou nebo koenzymovou (NAD+) vazebnou kapsu, prokázaly ve studiích in vitro, že eliminují aktivitu enzymu (19) a způsobují těžkou AME. Například Y226 se nachází v substrátové vazebné kapse (obr. 3A). Aromatický postranní řetězec fenolu tvoří hydrofobní interakce s aromatickým kruhem substrátu. Mutace Y226N nahrazuje tento zbytek nearomatickým zbytkem, což vede ke ztrátě hydrofobního stackingu, který narušuje vazbu substrátu (obr. 3A). Tato mutace navíc mění postranní řetězec z hydrofobního na hydrofilní, což je pro vazbu hydrofobního substrátu nepříznivé. Mutace A221V nahrazuje krátký postranní řetězec o něco objemnějším postranním řetězcem Val, čímž narušuje vazbu substrátu zmenšením objemu kapsy, zatímco mutace A221G snižuje hydrofobicitu a vnáší flexibilitu kolem rigidní vazebné kapsy (obr. 3B).

Náš model ukazuje, že polární skupina 17-OH v kortizolu je uložena v hydrofobní oblasti obklopené Y226, P227 a L229. Tato hydroxylová skupina v kortikosteronu chybí, což vede ke zvýšeným hydrofobním interakcím a ∼10krát vyšší vazebné afinitě k HSD11B2 ve srovnání s kortizolem (obr. S2A). Kromě ledvin je HSD11B2 exprimována také v placentě. Ačkoli mineralokortikoidní receptor není v této tkáni exprimován, HSD11B2 inaktivuje kortizol, aby eliminoval jeho růst inhibující a proapoptotické účinky během embryonálního vývoje. Během těhotenství se může vysoká hladina progesteronu v mateřské cirkulaci vázat na HSD11B2 a modulovat jeho aktivitu. To se může promítnout do účinků případných ztrátových mutací, které narušují vazbu progesteronu, na porodní hmotnost. Například mutace A221V vážně ovlivňuje vazbu progesteronu více než kortizolu kvůli sterickým střetům mezi Val a vystupujícími metylovými skupinami v progesteronu (obr. S2B). Velmi zajímavé je zjištění, že obě pacientky s mutací A221V byly malé na gestační věk (tab. S1). Stejně tak mutace A221G ovlivňuje vazbu progesteronu nepřímo změnou struktury vazebného místa. Podobně mutace Y226N je pro vazbu progesteronu škodlivější, protože snižuje hydrofobní interakce mezi progesteronovým skeletem a hydroxyfenylovým kruhem tyrozinu (obr. S2B). Naproti tomu P227 poskytuje vazebnému místu nepřímou strukturní podporu a mutace na Leu má podobný vliv jak pro kortizol, tak pro progesteron (obr. S2B).

Existují čtyři mutace, které se nacházejí ve vazebném místě pro koenzym a narušují ho, čímž vážně zhoršují aktivitu HSD11B2. Boční řetězec zbytku L179 je normálně prostorově umístěn v krátkém obratu mezi listem β4 a šroubovicí α4 (obr. 3C). Tím, že tyto interakce umožňují interakce s hydrofobními postranními řetězci V174 a L282, činí vazebné místo koenzymu flexibilnějším. Mutace na Arg zavádí guanidinový postranní řetězec, který umožňuje interakce s postranním řetězcem karboxylové skupiny E172 a postranním řetězcem hydroxylové skupiny T184 (obr. 3C), čímž vnáší do obratu rigiditu a snižuje flexibilitu potřebnou pro optimální funkci enzymu (7). Y232, který se nachází v koenzymové vazebné kapse, je vysoce konzervovaným zbytkem v Rossmannově skládacím motivu (20), což naznačuje, že jeho mutace bude mít negativní vliv na aktivitu enzymu (21). Hydroxylofenylový postranní řetězec Y232 vytváří důležité vodíkové vazby s N171 a NAD+, které udržují koenzym ve správné poloze pro jeho katalytickou funkci (obr. 3D). Tato interakce je u mutace Y232C narušena a způsobuje těžkou AME. Význam tohoto zbytku pro aktivitu enzymu byl nezávisle potvrzen několika inženýrskými mutacemi (21) (obr. 3D). U mutace G89D vykazuje postranní karboxylový řetězec Asp závažné sterické střety s ribózovou cukernou částí adenosinu, což ovlivňuje vazbu NAD+ (obr. 3E). Další upravená mutace K236R vede k narušení vazby NAD (obr. 3F). Mutace sice zachovává schopnost interakce s NAD+ prostřednictvím vodíkové vazby, ale ruší aktivitu enzymu (21).

Narušení strukturní stability HSD11B2 narušuje jeho terciární strukturu, což způsobuje výrazný útlum aktivity enzymu a závažnou AME. Zbytek L250 je umístěn v šroubovici α5 a jeho postranní řetězce se nacházejí v těsné hydrofobní kapse obklopené postranními řetězci L204, F246, W253, V255 a V257 (obr. 4A). Zbytky hydrofobní kapsy jsou uzamčeny iontově párovou interakcí mezi R208 a E249. Zavedení postranního řetězce Pro rozbíjí šroubovici α5 zavedením rigidity. Tato kapsa je také příliš těsná na to, aby se do ní vešel velký, objemný guanidinový postranní řetězec Arg (obr. 4A). Následná ztráta hydrofobicity v této oblasti ovlivňuje strukturní stabilitu. Další stabilní intrahelikální interakce iontového páru vzniká mezi D144 a R147 (obr. 4B). Tato interakce umožňuje těsné sbalení šroubovice α3 s přilehlými β-listy v blízkosti vazebného místa NAD+. Mutace D144V vede ke ztrátě této interakce a destabilizuje uspořádání balení (obr. 4B). Hydrofobní balení je narušeno také u mutace F185S, kdy je aromatický postranní řetězec fenylalaninu, obklopený hydrofobními zbytky V182, C188 a M189, nahrazen polárním postranním řetězcem serinu (obr. 4C). Podobně je hydrofobní postranní řetězec L363, obklopený zbytky M347, I350 a F362, umístěn do šroubovice (obr. 4D). Mutace L363P narušuje šroubovici a místní strukturní prostředí

Dále může několik mutací narušit balení proteinu HSD11B2 a zhoršit tak stabilitu zavedením objemnějšího zbytku. Reziduum A328 tvoří hydrofobní interakci s V215, I260, I325 a Y338 (obr. 4E). Nahrazením alaninu objemnějším Val zbytkem způsobuje mutace A328V sterické střety s postranním řetězcem I260 a Y338 z okolních β-listů (obr. 4E). Reziduum S180 je umístěno na smyčce a jeho postranní řetězec hydroxylové skupiny interaguje s postranním řetězcem a páteřním dusíkem T184 (obr. 4F). Tento postranní řetězec leží ve velmi zúženém prostoru a omezuje akomodaci jakéhokoli objemnějšího zbytku, což způsobuje sterické střety, ve skutečnosti beze změny struktury proteinu. Postranní řetězec Phe s objemným aromatickým kruhem, jako je tomu u mutace S180F, tedy není v této pozici tolerován (obr. 4F).

Více vodíkových vazeb a solných můstků mezi polárními zbytky stabilizuje terciární strukturu enzymu HSD11B2. Některé mutace způsobují ztrátu těchto interakcí, což vede k neaktivitě enzymu a těžkému AME. Například solný můstek mezi R208 a E249 je kritický (obr. 4G). Jeho ztráta, jako v případě mutací R208C a R208H, destabilizuje protein a vede k těžkému onemocnění (obr. 4G). Podobně D223 tvoří solný můstek s R337 (obr. 4H). Nahrazením tohoto solného můstku méně pevnou vazbou, vodíkovou vazbou, mění mutace D223N záporně nabitý zbytek na nenabitý polární zbytek, což vede k výraznému útlumu aktivity in vitro (22). To také naznačuje, že solný můstek hraje klíčovou roli při udržování stability a aktivity HSD11B2. Postranní řetězce R213 tvoří vodíkové vazby s páteřními atomy zbytků A331 a L329 (obr. 4I). Snížením těchto vodíkových vazeb, které pomáhají udržovat terciární strukturu proteinu, zhoršuje mutace R213C stabilitu enzymu (obr. 4I).

Klastr Arg/Tyr ze zbytků 335-339 byl již dříve zapojen do udržování stability proteinu, ačkoli přesný mechanismus zůstal nejasný (23). U pacientů s AME byly zaznamenány mutace zahrnující tato rezidua, včetně R337C a Y338H. Simulace modelů monomerního a dimerního HSD11B2 naznačují, že zbytek R337 tvoří interakci solného můstku s D223 a vodíkové vazby s OH skupinou Y339 (obr. 4J). Jejich interakce jsou zřejmě důležité pro udržení správného skládání a stability proteinu. Jeho mutace na Cys tedy ruší jak solný můstek, tak vodíkovou vazbu, čímž destabilizuje enzym a způsobuje těžkou AME. Geneticky upravené mutace tohoto zbytku dále ukazují, že R337K, který zachovává polaritu a kladný náboj, snižuje aktivitu enzymu o 70 %, zatímco R337A, který je podobný R337C, protože má nenabité a krátké postranní řetězce, inaktivuje HSD11B2 úplně (23) (obr. 4J). Ve stejném klastru Arg/Tyr mutace Y338 na His inaktivuje enzym a způsobuje těžkou AME. Náš model naznačuje, že tento zbytek Tyr tvoří hydrofobní interakce s A328 a vodíkové vazby s D327 (obr. 4K). Obě interakce pomáhají udržovat stabilitu proteinu, takže například záměna Tyr za His inaktivuje HSD11B2. Je to proto, že Y338H si sice zachovává schopnost vodíkových vazeb, ale má kratší postranní řetězce, které enzym destabilizují. Podobně není tolerována záměna Tyr za Phe v konstruktu Y338F. Zde jsou hydrofobní interakce zachovány, ale vodíková vazba je zrušena (23). A konečně, R337 a Y338 ve shluku Arg/Tyr jsou také vysoce konzervované napříč mnoha druhy; je tedy nepravděpodobné, že by jakékoli změny těchto zbytků byly tolerovány (23).

Uvádí se, že několik mutací způsobuje mírnější formu AME s méně závažnými klinickými a biochemickými projevy. Bylo prokázáno, že příslušné mutované konstrukty mají zachovanou aktivitu HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), což odpovídá méně závažnému klinickému fenotypu. Ze strukturního hlediska mohou tyto mutace buď nepřímo narušit vazbu substrátu (jako např. mutace P227L u jednoho z našich pacientů), nebo změnit strukturu proteinu (jako např. mutace R279C a R359W) a oslabit, nikoli však zrušit aktivitu enzymu (obr. 5). Pozoruhodné je, že ačkoli zbytek P227 neleží v pozici, která by přímo interagovala se substrátem, jeho sousední umístění s reziduem Y226 naznačuje, že může mít roli při vazbě substrátu (obr. 5A). Tento zbytek totiž tvoří „zalomení“ v oblasti smyčky, udržuje konformaci aktivního místa a také drží Y226 ve správné poloze pro optimální interakci se substrátem. Mutace tohoto zbytku na Leu (P227L) přeruší „zalomení“ a změní polohu Y226 (obr. 5A).

U pacientů s AME typu 2 byly identifikovány dvě nekonzervativní mutace, o nichž se předpokládá, že narušují terciární strukturu HSD11B2. R279 tvoří vodíkovou vazbu s páteří N171, která pomáhá udržovat a stabilizovat lokální prostředí proteinu (obr. 5B). Nahrazení R279 zbytkem, který netvoří vodíkovou vazbu, jako je tomu u mutace R279C, vede k mírnému útlumu, ale ne k úplnému odstranění aktivity HSD11B2 (24), což odpovídá mírnému klinickému fenotypu (obr. 5B). Další nekonzervativní mutace, R359W, mění vlastnosti postranního řetězce z nabitého na hydrofobní. Tím se mění lokální interakce ve struktuře proteinu, v níž kladně nabitý postranní řetězec R359 vytváří vodíkovou vazbu s karbonylovým kyslíkem páteře I350 (obr. 5C). Ztráta této interakce přispívá ke zvýšené strukturní flexibilitě, což způsobuje útlum aktivity enzymu. Pozoruhodné je, že R279C i R359W způsobují minimální narušení intramolekulárních interakcí a vyskytují se v blízkosti povrchu proteinu

.