Fluorescenční proteinové značky

Úvod

Fluorescenční proteiny (FP) se používají jako proteinové značky od poloviny 90. let 20. století především pro buněčnou biologii a fluorescenční mikroskopii. Tyto značky způsobily revoluci nejen v buněčné biologii tím, že umožnily zobrazit téměř jakýkoli protein, ale používají se také v biochemických aplikacích. Důležitým příkladem je imunoprecipitace a afinitní purifikace proteinů značených FP, kterou umožnil vývoj afinitních pryskyřic s vysokým výtěžkem, čistotou a afinitou, jako jsou například Nano-Traps společnosti ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).

V tomto blogu uvádíme přehled

• zelených fluorescenčních proteinů
• červených fluorescenčních proteinů
• sebeoznačujících proteinů, které vyžadují kovalentní spojení fluorescenční molekuly

Typy fluorescenčních proteinů

Většina výzkumníků používá vnitřně fluorescenční proteiny GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP nebo mCherry. Alternativně byly zavedeny extrinsicky fluoreskující nebo samooznačující proteiny, které vyžadují kovalentní spojení fluoreskující molekuly s nefluoreskujícím proteinem, např. proteinové značky SNAP, CLIP a Halo. Tyto samoznačovací fluorescenční proteiny mají díky vlastnostem fluorescenčních barviv určité výkonnostní výhody oproti intrinsicky FP.

Obrázek 1: Struktury fluorescenčních proteinů.

(A) Vnitřně fluoreskující proteiny (FP), jako jsou EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP atd. sdílejí pouze malý počet společných zbytků, ale všechny se skládají do konzervované β-barrel struktury. Jejich fluorescence vzniká cyklizací páteře a oxidací tří aminokyselinových zbytků ve středu tohoto soudku (zvýrazněno vpravo), což vede ke vzniku dvoukroužkového chromoforu. Tento chemický proces se popisuje jako zrání chromoforu, je vlastní záhybu proteinu a závisí pouze na proměnných prostředí, jako je teplota a koncentrace kyslíku, ale ne na dalších enzymech. Barva, fotostabilita, kvantový výtěžek a další spektrální vlastnosti intrinsicky fluoreskujících proteinů jsou výsledkem mutací v aminokyselinách, které tvoří chromofor nebo které se nacházejí v blízkosti chromoforu.

(B) Extrinsicky fluoreskující proteiny, jako je HaloTag, ve své základní apo-formě nefluoreskují. Pouze pokud se k proteinu HaloTag přidá vhodný aktivovaný fluorofor, bude tento fluorofor zachycen a kovalentně vázán zbytkem D106 HaloTagu, čímž se HaloTag stane fluorescenčním. (ID PDB pro struktury: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Zelený fluorescenční protein medúz (GFP) a jeho deriváty jsou stále nejčastěji používané fluorescenční proteiny v biomedicínském výzkumu. V poslední době byly zavedeny další zelené fluorescenční proteiny, které jsou odvozeny z jiných organismů. Tyto FP mají stejné základní složení jako GFP, ale na úrovni sekvence se značně liší. Proto vyžadují nové, specializované výzkumné nástroje, jako jsou protilátky.

Původní text: GFP

Zelený fluorescenční protein poprvé izoloval Osamu Shimomura v roce 1962 z medúzy Aequorea victoria. Má zelenou fluorescenci s dlouhým Stokesovým posunem (ex 395 nm; em 509 nm). O 30 let později se Douglasi Prasherovi nakonec podařilo naklonovat sekvenci GFP a Martin Chalfie tuto sekvenci exprimoval in vivo. Později laboratoř Rogera Tsiena vyvinula GFP v sadu skutečných výzkumných nástrojů. Shimomura, Chalfie a Tsien získali v roce 2008 Nobelovu cenu. Přednášku Rogera Tsiena o Nobelově ceně naleznete zde: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Vědci vyvinuli množství variant GFP s různými vlastnostmi. Tyto FP mají různé funkční a spektrální vlastnosti. Prvním významným vylepšením GFP byla mutace (S65T), která zvýšila intenzitu a stabilitu fluorescenčního signálu. Hlavní excitační pík byl posunut na 488 nm (Heim et al., 1995). Běžná varianta EGFP je upravená verze GFP, která usnadňuje praktické použití GFP v různých organismech a buňkách.

Zelený fluorescenční protein GFP je známý také jako avGFP, wtGFP a gfp10; EGFP jako enhanced GFP a GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

Podle zprávy z roku 2004 je TurboGFP rychle zrající a jasný dimerní zelený fluorescenční protein odvozený od CopGFP z kopepoda Pontellina plumata. Copepod TurboGFP je evolučně vzdálený od fluorescenčních proteinů odvozených od medúz, jako je EGFP, a sdílí pouze asi 20% sekvenční identitu s běžně používanými variantami GFP. Proto se většina protilátek proti GFP včetně GFP-Nanobody používaných v GFP-Trap na TurboGFP neváže.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen je odvozen od multimerního žlutého fluorescenčního proteinu kopinatce Branchiostoma lanceolatum. Proto je mNeonGreen evolučně vzdálen od FP odvozených od medúz. mNeonGreen a běžné deriváty GFP mají jen asi 20% sekvenční identitu. Vzhledem k nízké sekvenční podobnosti se očekává, že afinitní nástroje (tj. protilátky) pro varianty GFP se na mNeonGreen nebudou vázat. Jistě to bylo prokázáno u afinitních činidel společnosti ChromoTek (anti-GFP Nanobodies/ VHHs a protilátky).

Poprvé zveřejněno v roce 2013, mNeonGreen je až třikrát jasnější než GFP. Jedná se o nově vznikající monomerní univerzální zelenožlutý fluorescenční protein pro zobrazovací aplikace včetně mikroskopie se super rozlišením. Kromě toho mNeonGreen funguje jako akceptor pro azurové fluorescenční proteiny v aplikacích fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET). Zdá se, že jde o nejjasnější dosud známý monomerní zelený fluorescenční protein, který se vyznačuje rychlým zráním.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Srovnání GFP, TurboGFP, a mNeonGreen

.

.

Vlastnosti	EGFP (nejčastěji používaný derivát GFP)	turboGFP	mNeonGreen
Objev/. první zveřejnění
Původ	GFP z medúzy Aequorea victoria	CopGFP z kopepoda Pontellina. plumata	multimerní žlutý fluorescenční protein z kopinatce Branchiostoma lanceolatum
Rychlost zrání (při 37 °C)	25 min	25 min	10 min
Totožnost sekvence s EGFP	(100%)	~20%	~20%
Odvozeno od GFP?	Ano	Ne	Ne
Struktura	Slabá. dimer	Dimer	Monomer
Běžná varianta	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomerní eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Excitační/emisní maximum	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
Délka/molekulová hmotnost (MW)	239 aminokyselin, 26.9 kDa	2x 232 aminokyselin, 2x 26 kDa	237 aminokyselin, 26,6 kDa
Výzkumné nástroje nabízené společností ChromoTek	Imunoprecipitace: GFP-Trap Imnofluorescence: GFP-Booster, králičí protilátka proti GFP PABG1 Western blot: Kontrola: purifikovaný protein EGFP	Imnoprecipitace: TurboGFP-Trap	Imnoprecipitace: mNeonGreen-Trap Imnofluorescence: Myší protilátka proti mNeonGreen Western blot: Myší protilátka proti mNeonGreen

Červené fluorescenční proteiny (RFP) jsou FP, které emitují červenooranžové fluorescenční světlo. Prvním RFP, který byl komerčně dostupný, byl DsRed. Byl získán z mořských sasanek Discosoma sp. v roce 1999.

DsRed má některé imanentní praktické problémy: (i) Její doba zrání je přibližně 24 hodin, což ji činí nepoužitelnou pro krátkodobé experimenty. (ii) Tetramerní forma DsRed může ohrozit funkci proteinů, na které je navázána. (iii) Jeho fotostabilita je poměrně nízká.

V důsledku toho byl DsRed podroben mutagenezi řízené na místě, aby se stal běžně použitelným jako geneticky kódovaná fúzní značka. Nakonec byly vytvořeny monomerní deriváty RFP s lepšími fluorescenčními vlastnostmi (z hlediska jasu a fotostability) a vyšší účinností zrání. Kromě toho byly vytvořeny deriváty s oranžovou, červenou a daleko červenou fluorescencí. Tyto monomerizované verze RFP se staly cennými výzkumnými nástroji mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (známé také jako „mFruits“), mKO, mRFP (tzv. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2 a DsRed-Express atd.

Další RFP byly identifikovány u jiných prvohorních živočichů (tj. sasanek a korálů), ale i tyto proteiny byly většinou tetramery. Nebyly tedy zatím dále optimalizovány pro použití ve výzkumu.

mRFP (známý také jako mRFP1)

První monomerní varianta dsRed, geneticky upravená v laboratoři Rogera Tsiena, byla jednoduše označena jako mRFP (nebo mRFP1), tj. monomerní červený fluorescenční protein. Ve srovnání s dsRed se mRFP1 vyznačuje o něco nižší úrovní absorpce, kvantového výtěžku a fotostability. Jeho rychlost zrání je však asi 10krát rychlejší než u dsRed, což při expresi v živých buňkách vede k podobnému efektivnímu jasu.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry je pravděpodobně nejčastěji používanou variantou RFP. Jedná se o monomerní červený fluorescenční protein s širokou použitelností jako fúzní protein v různých typech buněk. Stejně jako ostatní mFruit RFP je mCherry odvozen z dsRed varianty mRFP1 prostřednictvím řízené evoluce v laboratoři Rogera Tsiena. Ve srovnání s ostatními mFruity má mCherry nejvyšší fotostabilitu, nejrychlejší rychlost zrání a vynikající odolnost vůči pH. Má však nižší kvantový výtěžek než mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Laboratoř Rogera Tsiena také vytvořila daleko červený monomerní derivát mRFP1/dsRed, nazvaný mPlum. Daleko červené FP jsou výhodné pro celotělové zobrazovací aplikace, protože hlavní tkáňové absorbéry, jako je voda, lipidy a hemoglobin, jsou v emisním rozsahu 650-900 nm téměř průhledné. Stejně jako většina RFP s červeným posunem má i mPlum rozšířený Stokesův posun.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Srovnání mCherry, mRFP (mRFP1), a mPlum

.

Vlastnosti	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Objev/první publikace
Původ	DsRed z mořské sasanky Discosoma sp.	DsRed z mořské sasanky Discosoma sp.	DsRed z mořské sasanky Discosoma sp.
Rychlost zrání (při 37 °C)	15 min	60 min	100 min
Struktura	Monomer	Monomer	Monomer
Agregace	ne	ne	ne
Excitační/emisní maximum	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Délka/ molekulová hmotnost (MW)	236 aminokyselin, 26.7 kDa	228 aminokyselin, 25,4 kDa	229 aminokyselin, 25,6 kDa
Výzkumné nástroje poskytované společností ChromoTek	Imnoprecipitace: RFP-Trap Imnofluorescence: RFP-Booster, protilátka proti potkanovi anti-RFP Western blotting: Myší anti-RFP protilátka	Imnoprecipitace: RFP-Trap Imnofluorescence: RFP-Booster, protilátka proti potkanovi anti-RFP Western blotting: Myší anti-RFP protilátka	Imnoprecipitace: RFP-Trap Imnofluorescence: RFP-Booster, protilátka proti potkanovi anti-RFP Western blotting: Myší anti-RFP protilátka

Vnější fluorescenční proteinové značky Halo, SNAP a CLIP vyžadují kovalentní zachycení malého fluorescenčního ligandu, aby se změnily ve fluorescenční protein. Za tímto účelem jsou tyto samooznačující proteinové značky odvozeny od enzymů, které katalyzují tvorbu chemických vazeb: Značky SNAP a CLIP jsou variantami O6-alkylguanin-DNA alkyltransferázy, které reagují s deriváty benzylguaninu, resp. benzylcytosinu. Značka HaloTag je odvozena od haloalkan dehalogenázy a reaguje s alkylhalidy (obrázek 1).

Všeobecně jsou vnitřní i vnější fluorescenční proteiny fúzovány se zájmovým proteinem, aby bylo možné jeho buněčné zobrazování a detekce. Externě fluoreskující proteiny však vyžadují přidání reaktivního fluoroforu, což má několik výhod:

• Vyšší kvantový výtěžek a fotostabilita
• Silná fluorescence v živých i fixovaných buňkách
• Širší výběr fluorescenčních barviv
• Jediný genetický konstrukt umožňuje volbu odlišných fluoroforů pro vícebarevnou fluorescenci. zobrazování/multiplexování
• Fluorescence se spustí až po přidání značky

Dostupnost tří externě fluoreskujících proteinů s různou substrátovou/ligandovou specifitou umožňuje jejich ortogonální použití v multiplexovaných experimentech, také v kombinaci s intrinsicky FP.

V závislosti na experimentálních potřebách lze použít ligandy prostupující buňkou na bázi tetrametylrhodaminu (TMR), Oregon Green, diAcFAM nebo kumarinu, které snadno procházejí buněčnou membránou pro značení intracelulárních proteinů. Alternativně lze pro rychlé značení buněčného povrchu použít ligandy založené na nepropustných fluoroforech, jako jsou Alexa Fluor® 488 a 660.

Srovnání HaloTag, SNAP-Tag, a CLIP-Tag

Vlastnosti	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Objevení/první zveřejnění
Původ	Haloalkan dehalogenáza z Rhodococcus rhodochrous	lidský O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferáza	lidská O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferáza
Struktura	Monomer	Monomer	Monomer
Reaktivita	Chloroalkanové deriváty	O6-benzylguaninových derivátů	Benzylcytozinových derivátů
Ligandů	Buněčně propustných nebo nepropustných barviv, fluorofory, biotin a kuličky	Buněčně propustná nebo nepropustná barviva, fluorofory, biotin a kuličky	Buněčně propustná nebo nepropustná barviva, fluorofory, biotin, a kuličky
Excitační/emisní maximum	Závisí na připojeném fluoroforu	Závisí na připojeném fluoroforu	Závisí na spřaženém fluoroforu
Délka/molekulová hmotnost (MW)	297 aminokyselin, 33.6 kDa	182 aminokyselin, 19,4 kDa	182 aminokyselin, 19,4 kDa
Výzkumné nástroje nabízené společností ChromoTek	Imnoprecipitace: Halo-Trap Western blotting: myší protilátka anti-HaloTag	Imnoprecipitace: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: protilátka proti potkanovi anti-SNAP/CLIP-tag®	Imnoprecipitace: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: krysí protilátka anti-SNAP/CLIP-tag®

HaloTag

Samoznak HaloTag byl odvozen od enzymu haloalkan dehalogenázy DhaA z Rhodococcus rhodochrous. Její aktivní místo bylo geneticky modifikováno tak, aby ireverzibilně vázalo substráty s chloroalkanovým linkerem. Díky tomuto typu sebevražedné inhibice již není možná regenerace jejího katalytického místa pro další dehalogenaci. V závislosti na zvoleném substrátu se HaloTag přemění na fluorescenční proteinovou značku nebo může být imobilizován například na agarosových kuličkách.

Jelikož se haloalkan dehalogenázy nevyskytují v eukaryotických buňkách a většině prokaryot, včetně E. coli, nebude docházet ke značení na pozadí.

SNAP-tag

Samoznačující proteinová značka SNAP-tag je odvozena od lidské O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferázy (hATG), která jako protein divokého typu odstraňuje poškození DNA alkylací. Výsledná varianta hAGT použitá jako značka SNAP reaguje kovalentně s deriváty O6-benzylguaninu (tj. fluorescenční značka konjugovaná s guaninovými nebo chloropyrimidinovými odcházejícími skupinami prostřednictvím benzylového linkeru) nevratným a vysoce specifickým způsobem. Při reakci značení je substituovaná benzylová skupina substrátu kovalentně navázána na značku SNAP.

CLIP-tag

CLIP-tag je modifikovaná verze značky SNAP, upravená tak, aby reagovala spíše s benzylcytosinem než s benzylguaninovými deriváty. Při použití ve spojení se SNAP-tagem umožňuje CLIP-tag ortogonální a komplementární značení dvou proteinů současně ve stejné buňce.

Průvodce výběrem fluorescenčních proteinů
Shaner N.C., Steinbach P.A. a Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Zelené fluorescenční proteiny:
Zelený fluorescenční protein
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Zvýšená zelená fluorescence
Heim, R., Cubitt A.B. a Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A a Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Jasný monomerní zelený fluorescenční protein odvozený od Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. a Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Červené fluorescenční proteiny:

Vylepšené monomerní červené, oranžové a žluté fluorescenční proteiny odvozené od červeného fluorescenčního proteinu Discosoma sp.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. a Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Monomerní červený fluorescenční protein
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. a Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evoluce nových proteinů bez protilátek prostřednictvím iterativní somatické hypermutace
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. a Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. a Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.

Halo, SNAP a CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al., 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. a Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. a Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

Obecná metoda kovalentního značení fúzních proteinů malými molekulami in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. a Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765

Fluorescenční značení fúzních proteinů COS-7 exprimujících SNAP-tag pro zobrazování živých buněk
Provost C.R. a Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

Pouze pro výzkumné účely.

Na produkty a technologie společnosti ChromoTek se vztahují udělené patenty a probíhající přihlášky, které vlastní společnost ChromoTek GmbH nebo jsou jí k dispozici na základě výhradní licence.

ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label a Spot-Trap jsou registrované ochranné známky společnosti ChromoTek GmbH. SNAP-tag je registrovaná ochranná známka a CLIP-tag je ochranná známka společnosti New England Biolabs, Inc. Nanobody je registrovaná ochranná známka společnosti Ablynx, společnosti Sanofi. Produkty ostatních dodavatelů mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami každého z příslušných dodavatelů. Prohlášení o produktech jiných dodavatelů jsou uvedena podle našich nejlepších znalostí.