Abstrakt
Disacharidázy (DS) jsou kartáčové enzymy zabudované v mikrovilózní membráně enterocytů tenkého střeva. U neléčené celiakie (CD) dochází k celkovému snížení aktivity DS. Tento článek podává přehled různých aspektů aktivity DS u CD: jejich užitečnost při diagnostice a jejich použití při testování toxicity in vitro. Ta nebyla ve výzkumu CD nikdy zavedena. S nedávným pokrokem v technikách organoidů tenkého střeva by však DS mohly být použity jako biomarker pro studie in vitro. To zahrnuje vytvoření samoobnovujících se epiteliálních buněk vypěstovaných z tkáně, které exprimují diferenciační markery, včetně enzymů kartáčového okraje. Stanovení aktivity duodenálního DS může poskytnout další informace při diagnostickém vyšetření CD: (i) kvantifikovat závažnost pozorovaných histologických změn, (ii) poskytnout prediktivní hodnoty pro stupeň vilózní atrofie sliznice a (iii) pomoci diagnostikovat CD v případech, kdy jsou pozorovány menší histologické změny. DS mohou také poskytnout další informace k posouzení odpovědi na bezlepkovou dietu, protože k výraznému zvýšení jejich aktivity dochází čtyři týdny po jejím zahájení. Různé endogenní a exogenní faktory ovlivňující DS mohou být také důležité při zvažování zkoumání úlohy DS u jiných stavů, včetně neceliakální glutenové senzitivity a nedostatku DS.
1. Úvod
U některých jedinců jsou gastrointestinální příznaky včetně průjmu spojeny s příjmem určitých forem sacharidů ve stravě. Příznaky lze přičíst jednomu nebo více deficitům enzymů sliznice tenkého střeva, které hydrolyzují disacharidy . Patří mezi ně nedostatek laktázy (vrozený a dospělý typ), nedostatek sacharázy a isomaltázy, nedostatek maltázy a glukoamylázy a nedostatek trehalázy. S výjimkou deficitu laktázy u dospělých jsou ostatní výše uvedené deficity poměrně vzácné . Jiné stavy, včetně celiakie (CD), které vedou k poškození tenkého střeva, mohou způsobit snížení aktivity disacharidázy (DS). Bylo také navrženo, že sekundární nedostatek DS může případně vysvětlovat příznaky u pacientů s CD, kteří mají intaktní klky .
Laktóza, která je trávena enzymem brush border laktázou, patří mezi špatně vstřebatelné sacharidy s krátkým řetězcem, často označované jako FODMAP (fermentovatelné, oligo-, di-, monosacharidy a polyoly). Bylo prokázáno, že snížení příjmu FODMAP zlepšuje gastrointestinální příznaky u pacientů s neceliakální glutenovou senzitivitou (NCGS) . Bylo prokázáno, že u NCGS mohou být důležité i jiné složky pšenice než lepek, konkrétně inhibitor amylázy-trypsinu . Nedostatek biomarkerů pro tento stav by mohl přimět vědce ke zkoumání potenciální role enzymů kartáčové hranice, jako je laktáza.
U neléčené CD je patrné celkové snížení aktivity DS . Před příchodem sérologického testování byly aktivity DS v tenkém střevě důležitými laboratorními parametry pro pomoc při diagnostice CD. Stanovení individuální aktivity DS mělo rovněž zásadní význam pro diferenciální diagnostiku vrozených metabolických poruch. Měření jejich aktivity pomáhá rozlišit primární a sekundární nedostatek DS . Primární typy nedostatků DS představují „vrozené chyby metabolismu“ určitého enzymu . Příkladem je vrozený nedostatek laktázy, při kterém jsou normální hladiny maltázy a sacharázy při snížené hladině laktázy. CD je sekundární nedostatek DS, protože všechny DS jsou sníženy v důsledku poškození sliznice tenkého střeva způsobeného lepkem .
K výraznému zvýšení aktivity DS dochází čtyři týdny po zahájení bezlepkové diety (GFD), ale jejich aktivita se opět sníží, pokud se pacienti s celiakií vrátí k normální stravě . U pacientů s léčenou CD vyvolává intraduodenální instilace lepku charakteristické histologické změny a s nimi spojené výrazné snížení disacharidázových aktivit během 3,5 hodiny . Snížení aktivit DS koreluje s histologickým stupněm biopsie, takže by DS mohly být použity jako biomarker CD.
Tento rukopis podává přehled různých aspektů aktivit DS u CD: jejich využitelnost v diagnostice a jejich použití při testování toxicity in vitro. Dále popisujeme nedávné pokroky v technikách organoidů tenkého střeva, včetně kokultivace s imunitními buňkami, které nabízejí vzrušující možnost vývoje nejmodernějších in vitro modelů pro výzkum CD. V tomto modelu by mohly být jako markery patogeneze CD použity brush border enzymy.
2. Diagnostické aspekty disacharidázových aktivit v tenkém střevě u CD
Zlatým standardem pro diagnostiku CD a sledování účinku GFD je vyšetření duodenální biopsie ve spojení se sérologickým vyšetřením CD včetně tkáňové transglutaminázy. Měření aktivity DS poskytuje další informace v době stanovení diagnózy a během následného sledování k posouzení odpovědi na GFD . Kromě toho se ukázalo, že stanovení aktivit DS může pomoci při diagnostice CD v případech, kdy jsou v biopsiích tenkého střeva pozorovány mírnější histologické změny, včetně abnormalit Marsh I a II .
2.1. Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty slizniční vilózní atrofie
Měření enzymových aktivit na hranici kartáčku nabízí další objektivní nástroj k posouzení závažnosti histologických abnormalit u neléčených pacientů s celiakií . Aktivity duodenálních DS jsou dobrými prediktory stupně slizniční vilózní atrofie u CD. Pozitivní prediktivní hodnoty pro středně těžkou nebo těžkou vilózní atrofii jsou následující:(i)90 % pro maltasu (maltasa U/g proteinu)(ii)86 % pro sukrasu (<40 U/g proteinu)(iii)71 % pro laktasu (<20 U/g proteinu).
Snížené aktivity maltasy a sukrasy mají tedy vysokou pozitivní prediktivní hodnotu pro stupeň slizniční vilózní atrofie. Prediktivní hodnoty aktivity laktázy jsou nižší, pravděpodobně v důsledku přítomnosti primárního deficitu laktázy u pacientů s celiakií. Žádný pacient s aktivitami DS v normálním rozmezí nevykazoval těžkou vilózní atrofii .
2.2. Hojení sliznice u CD s bezlepkovou dietou (GFD)
Je dobře známo, že u neléčených pacientů s celiakií je aktivita enzymů na hranici kartáčku snížena. Tyto aktivity se však během remise obnovují, zejména čtyři týdny po zahájení GFD . Je důležité si všimnout rozdílných reakcí mezi DS a GFD; dochází k výraznému zvýšení aktivit alfa-glukosidáz, zatímco aktivita laktázy zůstává u mnoha pacientů nízká . Peña et al. prokázali, že odpověď laktázy na GFD je variabilní, někdy se projeví úplným zotavením během několika měsíců, ale někdy zůstává snížená po celé roky . Velký význam pro rychlost obnovy aktivity laktázy má věk pacienta. Pacienti mladší 30 let obvykle vykazují plné zotavení v průběhu několika měsíců, zatímco většina starších pacientů vykazuje v tomto časovém úseku jen malé nebo žádné zotavení . Přetrvávání nízké aktivity laktázy navzdory dobrému histologickému zlepšení bylo prokázáno v jiných studiích u některých pacientů, zejména dospělých .
S výjimkou laktázy může měření DS poskytnout kvantitativní index zlepšení sliznice tenkého střeva ; jejich zvýšení dobře koreluje s obnovou sliznice na základě histologie biopsie tenkého střeva . Kromě histologického a sérologického sledování nabízí měření aktivity DS další potenciální nástroj pro hodnocení léčby CD pomocí GFD . Aktivita sukrázy je nejlepším ukazatelem slizniční odpovědi na GFD . Je však zajímavé, že ani po dvou letech léčby CD pomocí GFD se aktivita sukrázy v distálním duodenu nezvyšuje na úroveň kontrol, ačkoli klinické účinky jsou pozorovány dříve . Obecně jsou enzymové aktivity ve sliznici tenkého střeva pacientů s CD v remisi nižší než u kontrolních skupin odpovídajících věkem, pohlavím a místem biopsie . Pacienti s celiakií na GFD však mají významně zvýšené hladiny maltasy a sukrasy, ale omezené zvýšení aktivity laktázy ve srovnání s neléčenou skupinou . Za zmínku stojí, že přísná GFD je léčbou volby nejen u CD, ale také u sekundárních deficitů DS spojených s CD .
2.3 . Diagnostika CD s Marshovým skóre I/II biopsie sliznice tenkého střeva (subklinická CD)
U biopsie sliznice tenkého střeva s Marshovým skóre I a/nebo II není přítomna vilózní atrofie . Vilózní atrofie zahrnuje pouze konečné stadium v klinickém průběhu onemocnění; CD se vyvíjí postupně od zánětu sliznice tenkého střeva k hyperplazii krypt a nakonec k vilózní atrofii .
Mírnější bioptické změny, které se omezují na lymfocytární infiltraci s hyperplazií krypt nebo bez ní, mohou vyžadovat další údaje, aby se zvýšila jistota diagnózy CD, protože tyto histologické změny nejsou výlučné pro CD . Diagnózu CD může zvýšit genotypizace (HLA-DQ2 nebo HLA-DQ8); k potvrzení diagnózy lze také použít sérologické markery a imunohistochemické barvení γδ+ve intraepiteliálních lymfocytech, které se vyskytují u pacientů s CD .
Poškození mikrovilů může být jednou z prvních změn vyvolaných lepkem u CD . Proto mohou biochemické změny předcházet histologickým abnormalitám duodenální biopsie pozorovaným světelnou mikroskopií . Murray a kol. uvádějí diagnózu CD při opakované biopsii u 4 z 37 (10,8 %) pacientů, kteří neměli vilózní atrofii v původní biopsii před několika lety. Tito čtyři pacienti však měli v původní biopsii sníženou aktivitu DS a menší histologické změny (Marsh I nebo II). Snížené aktivity DS bez vilózní atrofie tedy mohou představovat časnou CD .
Mones et al. pozorovali výrazné snížení aktivit DS u dětských pacientů s CD, jejichž histologické změny v biopsii tenkého střeva byly hodnoceny jako Marsh I nebo II (s intaktními klky). Pozitivní test pro predikci CD byl definován následujícími hraničními hodnotami pro jednotlivé aktivity DS: laktáza, ≤15 jednotek/g proteinu; sacharáza, ≤25 jednotek/g proteinu; maltasa, ≤100 jednotek/g proteinu; a palatináza, ≤5 jednotek/g proteinu. Diagnostická citlivost se pohybovala od 74 % do 85 %, přičemž nejvyšší citlivost byla pozorována u laktázy. Diagnostická specifičnost se pohybovala od 57 % do 91 %, přičemž nejvyšší specifičnost byla zjištěna u sacharázy. Pozitivní prediktivní hodnota nedostatku DS pro předpověď CD se pohybovala od 70 % do 91 %. Negativní prediktivní hodnota (normální hladina DS) pro predikci biopsie nepovažované za CD se pohybovala od 72 % do 76 % . Deficit DS zjištěný v duodenálních biopsiích tedy může pomoci diagnostikovat CD v biopsiích s intaktními klky . Podobné zjištění bylo zaznamenáno v jiné studii, kde hodnocení aktivity DS poskytlo důkaz na podporu diagnózy CD u některých pacientů .
3. Výzkumné aspekty aktivity disacharidáz u celiakie
Aktivitu DS v biopsiích sliznice tenkého střeva lze stanovit Dahlqvistovou metodou. Tkáň se inkubuje s příslušným disacharidem a uvolněná glukóza se stanoví kolorimetricky pomocí TRIS-glukózooxidázového činidla. Jednotky aktivity DS se vyjadřují jako mikromoly hydrolyzovaného disacharidu za minutu na gram sliznice (mokrá hmotnost) .
3.1. Faktory ovlivňující enzymové aktivity
DS jsou u aktivní celiakie snížené. Mohou být sníženy i u jiných stavů včetně zánětlivých střevních onemocnění, potravinové alergie, dyspepsie, malabsorpce bílkovin a energie, imunodeficience a infekčních onemocnění (např. giardiózy, virových infekcí a bakteriálního přerůstání tenkého střeva) . Snížení aktivity DS lze obvykle zvrátit úspěšnou léčbou základního onemocnění. Zajímavé je, že DS může být abnormálně zvýšena také u diabetických pacientů . Snížení jednotlivých deficiencí DS je patrné u primárních deficiencí DS, mezi které patří vrozená intolerance laktózy, deficience sacharázy-izomaltázy, deficience maltázy-glukoamylázy a deficience trehalázy .
U zdravých jedinců mohou aktivity DS vykazovat široké rozmezí absolutních hodnot . Existuje několik endogenních a exogenních faktorů, které ovlivňují jejich aktivity.
3.1.1. Endogenní faktory
Aktivity DS se liší podél podélné osy (duodenum-jejunum-ileum) střeva . Laktáza má maximum aktivity v 50-200 cm od Treitzova vazu a téměř chybí v distálním ileu. Aktivity sukrázy jsou podél tenkého střeva konstantní. Maltáza je dvakrát hojnější v distálním ileu než v proximálním jejunu .
Etnická příslušnost ovlivňuje hodnoty DS, jak se ukázalo při srovnání afrických a finských dětí s normální vilózní architekturou; první z nich měly nižší aktivity duodenální laktázy, sukrázy a maltázy. Přibližně třetina finských dětí vykazuje aktivitu laktázy pod stanoveným referenčním rozmezím 20 U/g bílkovin, na rozdíl od dvou třetin afrických dětí .
Pohlaví nemá vliv na žádnou z aktivit DS . Věk má významný vliv pouze na aktivitu laktázy; ta s věkem klesá. U některých černošských dětí se může nedostatek laktázy objevit po 3. roce věku a není spojen s onemocněním sliznic .
Cirkadiánní rytmus ovlivňuje aktivity DS . Kromě toho oscilace aktivit DS korelují s rytmem příjmu potravy .
Patrné slizniční změny, které se mohou vyskytnout u CD, ovlivňují absolutní hodnoty aktivit DS zjištěné v biopsiích. Jonsson a kol. prokázali, že u vzorků odebraných ze dvou míst v duodenu existuje přibližně 30% variační koeficient aktivity DS.
3.1.2. V případě, že se jedná o vzorky odebrané ze dvou míst v duodenu, je třeba počítat s přibližně 30% variací. Exogenní faktory
Je známo, že podávání sacharózy zvyšuje aktivitu sacharázy-izomaltázy. Toto zvýšení je důsledkem de novo syntézy enzymu, která dosahuje svého vrcholu (2,6násobné zvýšení) 12 hodin po zahájení podávání stravy obsahující sacharózu . Degradace enzymu je nezávislá na stravě .
Hladovění brání obnově střevních epiteliálních buněk. Způsobuje snížení hmotnosti tenkého střeva, velikosti klků a mitotického indexu kryptových enterocytů. Deprivace sacharidů vyvolává pokles střevní sacharázy, který se obnovuje podáváním sacharidů .
Hladiny DS se také liší podle místa biopsie . To platí nejen pro podélnou osu (duodenum-jejunum-ileum) v tenkém střevě, ale také pro osu krypta-žilní řečiště. Vzhledem k tomu, že DS jsou zabudovány do mikrovilů vilózních enterocytů, je jejich aktivita závislá na počtu vilózních enterocytů přítomných v biopsii , takže povrchnější biopsie s vyšším obsahem epitelu mohou mít vyšší obsah DS.
3.2. Metody ex vivo a in vitro pro studium toxicity lepku u celiakie
Neexistuje zvířecí model reprodukující všechny znaky celiakie . Zlatým standardem pro hodnocení toxicity celiakie je testování in vivo . Je však dobře známo, že podávání lepku in vivo může způsobit systémové poškození pacienta. Proto se při posuzování potravin z hlediska absence toxicity pro CD obvykle před provedením studií in vivo používají metody in vitro .
Nejspolehlivější metodou in vitro je kultivace slizniční biopsie tenkého střeva, často označovaná jako orgánová kultura duodenální biopsie (OC). Tuto metodu původně popsali Browning a Trier . Existuje významný požadavek na preklinické studie in vitro, proto byl princip Browningovy a Trierovy metody dále rozvinut a použit pro testování probiotik, které vyžaduje apikální stimulaci střevních slizničních explantátů . OC umožňuje různé další aplikace, například biochemické studie syntézy a zpracování DS , dimerní sestavy DS a studium účinků inzulínu na zvýšenou aktivitu DS u diabetiků .
Původní metoda Browninga a Triera byla modifikována tak, že systém zjišťuje škodlivé účinky lepku jeho přidáním do kultivačního média a vyhodnocuje následné histologické, morfologické a imunologické abnormality. Modifikovaná Browningova a Trierova technika se stále široce používá ve studiích, které zkoumají patogenezi CD a při testování celiakální toxicity . Ukázalo se také, že systém OC je užitečný pro usnadnění diagnózy CD, a to hlavně v případech bez vilózní atrofie nebo u séronegativních pacientů .
3.2.1 . Rané práce na kultivaci orgánů tenkého střeva a studium enzymů na hranici kartáčku u CD
Poškození enterocytů je charakteristickým znakem celiakie . Toxický účinek lepku na sliznici tenkého střeva byl prokázán biochemicky měřením aktivity enzymu kartáčového okraje alkalické fosfatázy (AP) u OC. Aktivita AP získaná z biopsií neléčených pacientů s CD se zvýšila, když byla tkáň inkubována v bezlepkovém médiu. Toto zvýšení bylo inhibováno přítomností peptidů lepku v kultivačním médiu, což prokazuje toxické účinky lepku .
Katz a Falchuk následně navrhli použití techniky OC tenkého střeva jako prediktivního testu pro definitivní diagnózu citlivosti na lepek. U dvaadvaceti z 26 pacientů s diagnózou CD byla prokázána citlivost na lepek in vitro při počáteční biopsii. Vzestup aktivity AP střevní tkáně těchto 22 pacientů byl inhibován přítomností peptidů lepku v médiu. Míra falešné negativity při stanovení diagnózy CD tak byla 15 % (4 z 26). V jejich studii bylo také 14 pacientů s abnormální sliznicí, u kterých se CD neprokázala. U třinácti z nich nebyla prokázána citlivost na lepek in vitro (míra falešně pozitivních výsledků 7 %). Všichni pacienti s normální biopsií byli klasifikováni správně. Tyto zajímavé výsledky naznačují, že kultivace orgánů tenkého střeva by mohla být použita pro prospektivní diagnostiku CD. V další studii Falchuk et al. opět prokázali citlivost na lepek in vitro u pacientů s aktivní CD. Dále naznačili, že existují rozdíly podle typu histokompatibility subjektů.
Další vědci podnikli podobné studie OC, přičemž měřili aktivitu AP a dalšího enzymu kartáčové hranice α-glukosidázy. Howdle et al. a Hauri et al. nedokázali in vitro reprodukovat účinky lepku na duodenální biopsie od neléčených pacientů s CD ani pomocí hodnocení aktivity AP nebo α-glukosidázy.
Mitchell et al. prokázali, že během OC dochází k postupnému úbytku proteinů z tkáně. Současně dochází k poklesu hladin enzymů kartáčového okraje a jejich akumulaci v médiu. Navrhli proto vyjadřovat enzymové aktivity jako mU/ml kultivačního média, na rozdíl od U/g bílkovin, kvůli ztrátám bílkovin během kultivace orgánu a obnoveným enzymovým aktivitám v médiu .
Několik autorů zkoumalo bílkoviny, obsah DNA a enzymy kartáčového okraje v biopsii OC tenkého střeva. Většina z nich pozorovala pokles všech těchto parametrů v kultivovaných biopsiích s výjimkou aktivity AP, která se prakticky ve všech případech zvýšila . DS se pravděpodobně během kultivace ztrácejí do média snadněji než AP .
3.2.2. Ztráty při kultivaci jsou pravděpodobně vyšší než u AP. Buněčné modely a enzymové aktivity
Kromě OC sliznice tenkého střeva pacientů s CD použili vědci pro studie CD in vitro různé buněčné linie. Zavedené buněčné modely jsou založeny na liniích T buněk citlivých na lepek a klonech izolovaných od jedinců s CD, které se stále hojně používají při screeningu toxicity CD . Významné množství výzkumů bylo také provedeno s využitím epiteliálních buněčných linií nádorového původu, které se poměrně snadno pěstují. Není však zjištěno, do jaké míry maligní transformace ovlivňuje jejich případnou závislost na vlivech okolního mikroprostředí. Bylo prokázáno, že na rozdíl od normálních epiteliálních buněk nevyžadují buněčné linie rakoviny tlustého střeva pro svou expanzi in vitro přídavek růstových faktorů . Kromě toho buňky Caco2 exprimují ve srovnání s normálními enterocyty podstatně nižší množství enzymů kartáčové hranice .
Předtím, než Sato a spol. publikovali svůj průlomový objev týkající se střevních organoidů, bylo pěstování enterocytů in vitro notoricky obtížné. V průběhu desetiletí mnoho studií normálního střevního epitelu uvádělo potíže s udržením kultivace těchto buněk po dobu delší než několik dní ( a odkazy na ně), a to i přes použití různých izolačních protokolů a následných kultivačních podmínek. Po mnoho let se mělo za to, že dlouhodobé kultury z primární lidské tkáně nelze vytvořit, pokud buňky nejsou geneticky transformovány. Bylo také zjištěno, že narušení interakcí mezi normálními epiteliálními buňkami a okolní extracelulární matrix vyvolává apoptózu buněk .
Quaronimu a spol. se však podařilo založit dlouhodobou kulturu epiteliálních buněk tenkého střeva potkana. Jejich původní přístup k izolaci byl stejný jako u OC, ale kultivované epitelové buňky měly rysy nediferencovaných buněk krypt tenkého střeva. Nízká úroveň diferenciace kultivovaných enterocytů in vitro byla zaznamenána v jiných studiích s použitím lidských, myších, potkaních a hovězích střevních biopsií, které jsou v souladu s našimi pozorováními (nepublikované údaje). Rusu et al. studovali diferenciaci in vitro hodnocením specifických aktivit maltázy a AP ve vzorcích hovězích (a) čerstvě seškrábaných epitelů, (b) organoidních suspenzí použitých k nasazení kultur (nezaměňovat se Satoovými organoidy) a (c) střevních buněčných kultur, které zahrnují primárně kultivované buňky a buňky kultivované po první a druhé pasáži. Organoidní suspenze vykazovaly 50% redukci vzhledem k přípravě čerstvého epitelu. Aktivita maltázy používaná jako marker diferenciace zřetelně klesala v primárních kulturách a s dalšími pasážemi kultury směrem ke stabilní nízké úrovni. Podobné výsledky byly získány z měření aktivity střevní AP. Tyto výsledky odrážely ztrátu diferenciace buněk in vitro .
Epitel je pouze jednou (i) ze čtyř složek integrované funkční jednotky, která se dále skládá z (ii) extracelulární matrix, (iii) buněk mezenchymového původu a (iv) luminálních faktorů. Izolace enterocytů od jejich mezenchymálního prostředí vede ke ztrátě diferenciace . Netransformované lidské fetální buňky tenkého střeva pěstované na plastu mají vlastnosti nediferencovaných kryptových enterocytů . Postupné přidávání molekul pojivové tkáně a luminálních molekul k nemaligním lidským fetálním enterocytům in vitro vyvolalo spektrum změn epiteliálního typu buněk směrem k plné diferenciaci . Buněčná linie tenkého střeva potkana se rovněž diferencovala, což bylo hodnoceno výrazným zvýšením aktivity sukrázy, při kultivaci v přítomnosti mezenchymu . Normální vývoj a diferenciace epitelu tenkého střeva tedy závisí na interakci s mezenchymem a dalšími složkami .
Dlouhodobé kultivace normálních primárních lidských epiteliálních buněk izolovaných z tenkého střeva jsou nyní dobře zavedeny. Lidské epitelové „mini-střevo“ lze vypěstovat ze střevních krypt a jednotlivých kmenových buněk . Je možné množit organoidní kultury in vitro, které jsou odvozeny z myšího i lidského střeva . Tyto organoidy lze pěstovat neomezeně dlouho a vykazují všechny charakteristické znaky epitelu tenkého střeva, pokud jde o architekturu, typy buněk a vlastnosti sebeobnovy .
Sato a kol. definovali podmínky, které podporují proliferaci a diferenciaci organoidů. Kmenové buňky i organoidy musely být vloženy do Matrigelu, což je matrice bohatá na laminin a kolagen, která napodobuje bazální lamelu. Kultivace lidského tenkého střeva je složitější než kultivace myšího střeva. Kromě R-spondinu, Nogginu a epidermálního růstového faktoru vyžadují kultivační podmínky optimalizované pro člověka více doplňků (Wnt3A, gastrin, nikotinamid, inhibitor Alk a inhibitor p38). Diferenciace kultivovaných lidských malých epiteliálních organoidů na různé typy buněk střeva vyžaduje stažení některých doplňků (Wnt3, nikotinamid a inhibitor p38). Diferenciační marker pro zralé enterocyty byl vizualizován barvením kartáčového okraje AP . V jiné studii Middendorp et al. rovněž vynechali určité kultivační doplňky, aby dosáhli diferenciace lidských organoidů na tenké střevo. Zajímavé však je, že vizualizace zralých enterocytů pomocí barvení sacharózou a isomaltázou fungovala dobře pro ileální organoidy, ale ne pro duodenální. Exprese laktázy byla indukována u ileálních i duodenálních organoidů pomocí tzv. diferenciačního média .
3.2.3. Nejnovější pokroky v metodách střevních organoidů
Organoidní technologie by mohla mít využití v regenerativní terapii některých střevních onemocnění prostřednictvím expanze střevních epitelů ex vivo a transplantace . Tato metodika rovněž umožňuje in vitro množení nemocných gastrointestinálních tkání, což by mohlo objasnit patogenezi onemocnění a vývoj terapií . Střevní organoidy již byly použity k modelování monogenních onemocnění, která postihují epitel, zánětlivých střevních onemocnění (zkoumání buněčné smrti, integrity sliznice a účinků zánětlivých cytokinů) a interakcí mezi střevními tkáněmi a mikroby, jakož i rakoviny ( a odkazy na ně) . Výzkum CD za těmito pokroky zaostává. Je dobře známo, že do patogeneze CD je zapojeno mnoho typů buněk, a proto organoidy postrádají mnoho typů buněk přítomných v systému in vivo. Komplexnost však lze zvýšit kokulturou s imunitními buňkami . Nozaki a kol. popsali kokulturu myších organoidů a intraepiteliálních lymfocytů (IEL), v níž se úspěšně množily jak αβT, tak γδT buňky a byly stejně pohyblivé jako IEL sídlící v prostředí in vivo. Kokultury organoidů byly popsány také pro střevní nervový systém a myofibroblasty .
Vzhledem k pokrokům v sérologickém a genetickém testování při diagnostickém vyšetření celiakie již nemusí být u mnoha pacientů nutná biopsie duodena. Bioptický materiál se tedy stane nedostatkovým. Střevní organoidy lze však také vytvářet z embryonálních kmenových buněk nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk ( a odkazy na ně), které sice vyžadují delší čas na založení a jsou technicky náročnější a nákladnější na rozdíl od organoidů získaných biopsií, ale mohou výrazně zvýšit počet výsledných organoidů a umožnit, aby se klinický materiál místo toho použil k chovu imunitních buněk.
3.2.4. Střevní organoidy a organoidy z biopsií Význam práce se střevními organoidy a enzymy kartáčové hranice pro vývoj nejmodernějších in vitro metod pro výzkum CD
Je dobře známo, že v patogenezi CD se spouštějí vrozené a adaptivní imunitní reakce ; přesná posloupnost těchto patologických dějů však dosud nebyla objasněna. Organoidní technologie však umožňuje postupné přidávání buněk do kokultury, čímž umožňuje studium vrozené imunitní odpovědi rekonstitucí celiakálních organoidů a IEL odděleně od účinků adaptivní imunitní odpovědi. Do tohoto in vitro modelu CD lze pak naopak zahrnout gluten-specifické T-lymfocyty, které lze rovněž pěstovat in vitro, a usnadnit tak plné toxické působení lepku na střevní epitel.
Organoidní technologie rovněž umožňuje objasnit úlohu enterocytů při zpracování gliadinových peptidů u CD. Enterocyty mají schopnost fungovat jako antigen prezentující buňky, přičemž stimulace T buněk je zprostředkována jejich molekulami HLA-DR . Dále gliadin obsahuje peptidy, které mohou vyvolat vrozenou imunitní odpověď . Zajímavé je, že glutenové peptidy, které spouštějí vrozenou imunitu u celiakie, jsou v enterocytu zpracovávány jinak než peptidy spouštějící adaptivní imunitní odpověď, kdy se peptidy dostávají do HLA-DR pozitivních pozdních endozomů a jsou prezentovány T buňkám lamina propria . Vzhledem k tomu, že poškození kartáčové hranice enterocytů je jednou z prvních změn u CD, mohla by být DS použita ke studiu toxických účinků lepku u CD. Je důležité poznamenat, že enzymy kartáčové hranice jsou nedílnou součástí zralých vilózních enterocytů a kvantitativně souvisejí s jejich diferenciací . Aktivita DS však nemusí korelovat s životaschopností enterocytů, protože aktivity enzymů na hranici kartáčku byly prokázány u neživotaschopných epiteliálních buněk . Proto by jako marker patogeneze CD mohlo být použito imunobarvení nebo přesněji nedostatek imunobarvení enzymů kartáčové hranice v důsledku destrukce mikrovilů, nikoli jejich aktivity.
Organoidní technologie má značný potenciál pro modelování onemocnění, a tedy objasnění posloupnosti patogenních dějů u CD, při nichž lze využít enzymů kartáčové hranice. Nové modely in vitro založené na nedávných pokrocích ve výzkumu kmenových buněk mohou usnadnit vývoj nových terapeutických strategií u CD.
4. Závěry
Struktura sliznice tenkého střeva a související fyziologické procesy jsou velmi složité. CD tuto složitost zvyšuje, protože postihuje mnoho složek střeva včetně DS. Navzdory skutečnosti, že aktivity DS hrají důležitou roli při diagnostice CD, aplikace aktivit DS ve výzkumu in vitro u CD stále není zavedena. Nedávné pokroky v pěstování epiteliálních „mini střev“ ex vivo představují novou vzrušující platformu, která se stala dostupnou. Umožňuje aplikace ke studiu normálního nebo nemocného epitelu pomocí tkáňového inženýrství. Epitelové buňky rostou a diferencují se za definovaných podmínek, které zahrnují přítomnost extracelulární matrix a růstových faktorů. Samoobnovující se populace epiteliálních buněk exprimuje enzymy kartáčové hranice, které by mohly být využity při in vitro studiích CD, kdy dochází k rekonstituci dalších imunitních buněk do modelu.
Konflikty zájmů
Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.
Poděkování
Autoři by rádi poděkovali Dr. H. Julii Ellis za užitečné diskuse a recenzi rukopisu. Tanja Šuligoj by ráda poděkovala Clinical Research Trust za podporu. Borut Božič by rád poděkoval za částečnou finanční podporu Slovinské vědecké nadace, grant č. 1. SZF-BBozic01/2007.