Důkaz pozitivní selekce působící na lokus genu pro lidský dopaminový receptor D4

Výsledky a diskuse

Sady primerů byly vybrány tak, aby amplifikovaly čtyři exony genu DRD4 s vysokým obsahem GC (1), jakož i přilehlou promotorovou oblast a splice junctions (obr. 1). Počáteční resekvenování celé promotorové a kódující oblasti genu DRD4 od 20 probandů s ADHD (údaje nejsou uvedeny) odhalilo řadu již dříve popsaných polymorfismů. Tyto polymorfismy zahrnovaly dva inserční/deleční polymorfismy, jeden v promotorové oblasti (4,3 kb před VNTR; ref. 18 a 19) a jeden v exonu 1 (2,7 kb před VNTR; ref. 20; viz obr. 1). Kromě toho byla odhalena řada nových kódujících SNP v exonu 3 VNTR (2) a také dva dříve nezaznamenané SNP v intronu 3, vzdálené od sebe 20 nt a ≈350 bp po proudu od středu VNTR (obr. 1). Vzhledem k vysoké úrovni polymorfismu VNTR zjištěné v tomto počátečním vzorku bylo provedeno rozsáhlejší resekvenování PCR 600 alel VNTR v exonu 3, získaných ze vzorku celosvětové populace (ref. 3 a 17; tab. 1; obr. 2). Tento vzorek obsahoval jedince reprezentující většinu hlavních zeměpisných původů (viz Metody). Většina jedinců byla heterozygoty a oba alelické produkty PCR bylo možné před sekvenováním oddělit gelovou elektroforézou, což poskytlo jednoznačné haplotypy. Celkem jsme prověřili více než 450 000 bp genomové DNA a 2 968 48bp repetic.

Na 600 sekvenovaných chromozomech bylo nalezeno 56 různých haplotypů (tabulka 1). Tyto haplotypy se skládaly z 35 různých 48bp variantních motivů (obr. 2), z nichž 19 bylo popsáno již dříve (označeno α-ξ na obr. 2; pozn. 2). Navrhujeme, aby tyto 48-bp variantní motivy DRD4 byly označeny čísly, jak je uvedeno na obrázku, a ne písmeny, která byla použita dříve (2), protože v řecké abecedě není dostatek znaků. Navrhujeme, aby varianty exonu 3 DRD4 byly označovány v uvedeném formátu, tj. nejběžnější alela 4R byla označena 4R(1-2-3-4) atd.

Záměrně jsme přibližně 2krát převzali vzorky alel jiných než 4R, protože u běžné alely 4R (tabulka 1) byla odhalena malá sekvenční variabilita, přestože představuje 65 % frekvence světové populace (3, 17). Většina haplotypů v tomto vzorku (85,7 %) byla nalezena s frekvencí menší než 1 % (tab. 1). Při pohledu na nukleotidovou diverzitu mezi variantami definovanými jejich VNTR číslem vykazují nejmenší diverzitu běžné alely 2R, 4R a 7R, přičemž 78,2, 95,2, resp. 88,9 % alel představují nejběžnější haplotypy 2R(1-4), 4R(1-2-3-4) a 7R(1-2-6-5-2-5-4) (tab. 1). Naproti tomu alely 3R, 5R, 6R a 8R jsou sice vzácnější, ale mají proporcionálně více variant (tab. 1). Tento neobvyklý vzorec diverzity alel zjevně není prostým efektem délky, tj. delší alely mají větší diverzitu. Bylo pozorováno mnoho populačně specifických vzácných haplotypů. Příkladem je haplotyp 2R(30-4) nalezený pouze ve vzorku Surui (Jižní Amerika) a haplotyp 5R(1-3-2-3-4) nalezený pouze ve vzorku Han Chinese (Asie) (Tabulka 1 a Obr. 2).

Vzorce nukleotidové variability pozorované u haplotypů VNTR není náhodný (Obr. 2). Většina variant sekvence DNA mění sekvenci aminokyselin, někdy poměrně výrazně (např. Gln na Pro; obr. 2). Ačkoli mnoho z těchto variant jsou příbuzné mutační události (níže), lze tyto vztahy zohlednit při výpočtu Ka/Ks (poměr počtu aminokyselinových záměn na jedno místo dělený odhadem počtu synonymních změn). Hodnoty Ka/Ks větší než 1 se obvykle považují za přísný ukazatel pozitivní selekce ve sledovaném úseku DNA (22, 23). Pro sekvenci tandemových repetic lze odvodit mnoho předpokládaných vztahů, a proto lze vypočítat různé poměry Ka/Ks. Pro všechny předpokládané vztahy variant DRD4 však platí Ka/Ks > 1. Například za předpokladu, že všechny nejhojnější motivy 1-6 variant (obr. 2) mají společný původ a že diverzita vznikla mutací i rekombinací (níže), dostaneme hodnotu Ka/Ks 3. Rozšíření této analýzy o mezidruhovou divergenci (což je účinná metoda pro zlepšení těchto výpočtů) není možné z důvodu rychlého de novo generování variací v tomto VNTR v liniích primátů (28).

Standardní přístupy k definování evolučních vztahů mezi těmito haplotypy nejsou použitelné z důvodu repetitivní povahy sekvence DNA (23). Na základě pozorovaných sekvencí DNA a jejich nukleotidových variací je však jednoduché navrhnout jednoduchý původ většiny těchto haplotypů (obr. 3; tab. 1). Jednokrokové rekombinační/mutační události mezi nejčastějšími alelami mohou vysvětlit téměř veškerou pozorovanou variabilitu alel 2R-6R. Na obr. 3 je zjednodušené schéma navržených nejčastějších rekombinačních událostí. Přestože nelze určit předpokládanou nukleotidovou sekvenci předka DRD4, zdá se, že všechny alely u určitého druhu primátů pocházejí z relativně nedávného společného předka (28). Nejrozšířenější alela 4R je navrhována jako alela lidského předka na základě (i) omezených sekvenčních údajů uváděných pro alely 4R DRD4 primátů (28), (ii) nižší úrovně LD pro polymorfismy obklopující tuto alelu (jak je uvedeno níže) a (iii) uspořádání sekvenčních motivů alel jiných než 4R. Nerovnoměrnou rekombinací mezi dvěma alelami 4R(1-2-3-4) by vznikly pozorované společné alely 2R-6R (obr. 3). Poloha křížení určuje výslednou sekvenci. Například nejběžnější alely 3R(1-7-4) a 3R(1-2-4) se liší pouze polohou křížení buď uvnitř, nebo za druhou repeticí (obr. 3; tab. 1). Známá vysoká frekvence nerovnoměrné rekombinace mezi tandemovými repeticemi (29) tak může vysvětlit většinu pozorované diverzity genu DRD4.

Kromě nerovnoměrného křížení jsou v tomto vzorku populace patrné jednobodové mutace (tab. 1 a obr. 2). Například až na jednu výjimku mají všechny alely 2R na celém světě sekvenci 2R(1-4) (tab. 1). U všech 12 alel 2R resekvenovaných z DNA Surui (Jižní Amerika) byla zjištěna jediná bodová mutace, alela 2R(30-4) (tab. 1 a obr. 2). Tato mutace, změna C na T v první repetici, nemění sekvenci aminokyselin a pravděpodobně má nedávný (méně než 10 000-20 000 let) původ (24).

Naproti tomu vznik pozorovaných alel 7R a vyšších nelze vysvětlit jednoduchou jednostupňovou rekombinací/mutací z haplotypu 4R(1-2-3-4) (obr. 3). Vznik alely 7R z nejrozšířenější alely 4R by vyžadoval nejméně jednu rekombinaci a šest mutací. I při připuštění složitějších genových konverzí je k přeměně alely 4R na alelu 7R zapotřebí více kroků s nízkou pravděpodobností (obr. 3). Například centrální pětivariantní motiv, který se nachází v běžném haplotypu 7R(1-2-6-5-2-5-4), by mohl vzniknout rekombinací mezi dvěma alelami 4R. Rekombinace mezi koncovým čtyřvariantním motivem jedné alely 4R a počátečním jednovariantním motivem druhé alely 4R by dala vzniknout haplotypu 7R(1-2-3-5-2-3-4) (obr. 2). Ke vzniku současného haplotypu 7R(1-2-6-5-2-5-4) jsou pak zapotřebí tři další mutace každého ze dvou tří variantních motivů v tomto předpokládaném haplotypu 7R. Čtyři z těchto šesti nukleotidových změn jsou nesynonymní a mění sekvenci aminokyselin (Ser na Gly, Gln na Pro, Ala na Pro a Ser na Gly; obr. 2). Ačkoli by jako mechanismus „vložení“ těchto nukleotidových změn do hypotetické alely 7R(1-2-3-5-2-3-4) mohla být navržena spíše genová konverze než mutace, byly by nutné dvě nepravděpodobné události, z nichž jedna by zahrnovala genovou konverzi alely 7R-7R (obr. 2 a 3).

Žádný z těchto předpokládaných „přechodných“ haplotypů 7R nebyl v tomto celosvětovém vzorku populace pozorován. Náš vzorek zahrnoval 47 alel 7R sekvenovaných od jedinců afrického původu, o nichž se předpokládá, že obsahují populace s největší genetickou rozmanitostí a stářím (24). Je tedy nepravděpodobné, že by se přechodné haplotypy 7R vyskytovaly s vysokou frekvencí. Naším záměrem však není navrhnout konkrétní původ alely DRD4 7R. Spíše chceme zdůraznit, že na základě analýzy sekvence DNA se alela DRD4 7R zdá být zcela odlišná od běžných alel 2R-6R. Nelze určit, zda vznik alely DRD4 7R byl jedinou, velmi nepravděpodobnou událostí, nebo sérií nepravděpodobných událostí (obr. 3).

Bez ohledu na mechanismus vzniku alely DRD4 7R je zřejmé, že je schopna účastnit se rekombinačních událostí s ostatními alelami. Většina pozorovaných vzácných haplotypů 7R se jeví jako rekombinační události, většinou se společnou alelou 4R(1-2-3-4) (tabulka 1). Například haplotyp 7R(1-2-6-5-2-3-4) se zdá být rekombinací mezi alelou 4R(1-2-3-4) a alelou 7R(1-2-6-5-2-5-4) (tab. 1 a obr. 2). Tento původ byl potvrzen analýzou SNP mimo oblast rekombinace (viz níže). Dále lze původ některých vzácných alel 5R a 6R a všech alel 8R a vyšších vysvětlit rekombinacemi zahrnujícími alelu 7R, protože obsahují šestivariantní motiv jedinečný pro alelu 7R (obr. 2 a tab. 1). Mnohé z těchto alel 8R a vyšších však mají na základě analýzy sekvence DNA zřejmě složitější původ (tab. 1 a obr. 2).

Tento model (obr. 3) vysvětluje zdánlivou anomálii v pozorované diverzitě haplotypů zaznamenanou výše (tab. 1), kde nejhojnější (a nejstarší, viz níže) alela 4R má nejnižší nukleotidovou diverzitu. Pokud je rekombinace převládajícím generátorem diverzity, pak se předpokládá, že většina rekombinačních událostí 4R-4R bude mít nezměněnou nukleotidovou sekvenci. Takové události lze odvodit pouze z rekombinace vnějších markerů. Pouze v případě, že dojde k neregistrované rekombinaci, vzniknou nové varianty nukleotidové sekvence (a délky) (obr. 3). Pozorovaný vzorec haplotypové diverzity odpovídá převážně „2-alele“ systému (4R a 7R), přičemž většina vzácnějších variant vzniká rekombinací z těchto dvou haplotypů (obr. 3).

Neobvyklá povaha sekvenční organizace alely DRD4 7R, která naznačuje, že vznikla jako vzácná mutační událost, nás vedla ke zjištění, zda existují rozdíly v LD mezi alelami 4R a 7R. Haplotyp dvou sousedních intronických SNP (G/A-G/C; obr. 1) bylo možné určit přímo, protože byly přítomny na stejném produktu PCR použitém k amplifikaci 48-bpVNTR. Mezi párem A-C SNP a alelou 7R byla zjištěna silná LD (obr. 3). Devadesát sedm procent alel 7R bylo spojeno s párem A-C SNP (66 z 68 zkoumaných). Dvě alely 7R spojené s G-G SNP byly rekombinantní haplotypy 7R-4R, jak byly původně určeny z analýzy sekvence DNA (výše). Naproti tomu oba páry G-G a A-C SNP jsou spojeny s alelami DRD4 4R (487 zkoumaných alel). Nejčastější je však pár G-G, který představuje 86,1 % afrického vzorku, ale až 98,6 % našeho asijského vzorku.

Všechny africké alely 7R byly spojeny s haplotypy A-C, zatímco s haplotypem A-C bylo spojeno pouze 13,9 % afrických alel 4R. Analýza sekvence DNA několika vzorků šimpanzů a bonobo (údaje nejsou uvedeny) naznačuje, že pár G-G SNP je pravděpodobně ancestrální sekvencí (obr. 3). Zdá se tedy, že původní alela DRD4 7R vznikla na tomto vzácnějším pozadí A-C SNP. Vzorek 73 alel 2R, 3R, 5R a 6R vykazoval přibližně stejnou asociaci s G-G a A-C SNP, což je v souladu s jejich předpokládaným rekombinačním původem z alel 4R i 7R (obr. 3). Zajímavé je, že všech 26 zkoumaných asijských vzorků s alelami 2R vykazovalo asociaci s A-C SNP, což naznačuje jejich původ z rekombinací zahrnujících alely 7R (obr. 3).

Podobné výsledky byly získány pro vzdálenější promotorové a exonové 1 inserční/deleční polymorfismy (obr. 1). V tomto případě byla asociace odvozena nepřímo z údajů získaných pro naše předchozí populační studie (3, 17) a z PCR analýzy podskupiny jedinců použitých v této studii. U 40 vzorků, kde byla k dispozici také rodičovská DNA a bylo možné ji genotypizovat pro tyto markery, bylo možné fázi odvodit přímo. Byla pozorována silná asociace mezi dlouhým (duplikovaným) promotorovým polymorfismem L1 (obr. 1) a alelou 7R (obr. 3), přičemž 90,8 % alel 7R bylo asociováno s L1 (analyzováno 607 alel). Naproti tomu polymorfismus L1 je spojen pouze s 61,9 % alel 4R (2 102 analyzovaných alel). Ačkoli byly pozorovány rozdíly specifické pro jednotlivé populace (například více L1-4R vazeb u čínské než africké populace), celkově bylo zjištěno jen málo vazeb L1-4R (obr. 3). Užší polymorfismus L2 v exonu 1 (obr. 1) byl spojen s 93,4 % alel 7R a 86,4 % alel 4R, což je relativní rozdíl podobný tomu, který byl pozorován u spojení L1-7R a L1-4R. Polymorfismus L2/S2 se však nachází v kódující oblasti a selekční omezení mohou mít vliv i na frekvenci alel (30).

Standardní metody odhadu doby koalescence pro tyto alely nejsou použitelné vzhledem k repetitivnímu charakteru oblasti a vysoké frekvenci rekombinace. Výpočty stáří alel založené na relativně vysoké celosvětové populační frekvenci alel DRD4 4R a 7R však naznačují, že tyto alely jsou staré (>300 000 let; ref. 25 a 26; viz Metody). Na druhou stranu výpočty stáří alel založené na pozorované intraalelické variabilitě (ref. 26 a 27; viz Metody) naznačují, že alela 7R je 5-10krát „mladší“ (30 000-50 000 let). Takto velké rozdíly mezi stářím alel vypočteným těmito dvěma metodami se obvykle považují za důkaz, že selekce zvýšila frekvenci alely na vyšší úroveň, než se očekává na základě náhodného genetického driftu (26). Absolutní hodnoty těchto odhadů jsou značně ovlivněny předpoklady použitými při jejich výpočtech, například předpokládanou frekvencí rekombinace (26). My jsme použili konzervativní odhady frekvence rekombinace založené na průměru pozorovaném pro terminálních 20 megabází 11p (31). Vzhledem k pozorované vysoké rekombinaci v tomto lokusu (tab. 1 a obr. 3) je pravděpodobné, že skutečné stáří alely 7R je ještě mladší, a další analýza LD tyto odhady upřesní. Důležitým závěrem však je, že bez ohledu na předpokládané parametry zůstávají relativní rozdíly ve stáří alel 4R a 7R vypočtené z intraalelické variability velké, zatímco jejich populační frekvence naznačuje, že jsou obě staré.

Nejjednodušší hypotéza vysvětlující (i) pozorovanou odchylku v nukleotidových změnách (Ka/Ks), (ii) neobvyklou sekvenční organizaci alely DRD4 7R a (iii) silnou LD obklopující tuto alelu je, že alela 7R vznikla jako vzácná mutační událost (nebo události), která se nicméně pozitivní selekcí zvýšila na vysokou frekvenci. Výhodným alelám obvykle trvá dlouho, než dosáhnou frekvence 0,1, a pak se rychle zvyšují na vysoké frekvence (>0,9). I když je možné, že pozorujeme nedávné rozšíření vysoce výhodné alely 7R, domníváme se, že je pravděpodobnější, že tento systém dvou alel DRD4 (obr. 3) je příkladem vyvážené selekce. Taková selekce může být v lidském genomu rozšířenější, než se obecně předpokládá (24). Model vyvážené selekce navrhuje, aby se v lidských populacích udržovaly vysoké frekvence alel 4R i 7R. Pro takovou vyváženou selekci lze navrhnout různé mechanismy, od výhody heterozygotů až po selekci závislou na frekvenci (24). Podle evoluční teorie her (32) bude evoluční výhoda pro určitý typ osobnosti záviset na stávajícím rozložení typů osobnosti. Například vysoká agresivita může vést k vysoké zdatnosti, pokud jsou téměř všichni mírní, ale může mít za následek nízkou zdatnost, pokud je velmi častá, protože agresivní jedinci budou trpět sankcemi za časté konflikty. Lze očekávat, že tento typ selekce závislé na frekvenci se bude uplatňovat u mnoha typů psychologických variací, včetně těch, které jsou spojeny s tímto konkrétním neurotransmiterovým receptorem (4-9).

Alternativní vysvětlení navrhovaného pozitivního výběru, jako jsou nedávné náhodné úzké hrdlo, populační expanze a/nebo příměs populace (24), jsou méně pravděpodobná pro vysvětlení pozorovaných výsledků. K úzkým hrdlům jistě docházelo během lidské migrace a evoluce (33-35) a nepochybně ovlivnily současnou celosvětovou frekvenci alel DRD4. Četné populační studie jiných genů (24, 33, 35) ukázaly, že pravděpodobně došlo k „mimoafrickému“ zúžení alelové diverzity (a zvýšení LD). V této studii byla zjištěna větší diverzita (a nižší LD) u afrických alel DRD4 4R ve srovnání se zbytkem našeho populačního vzorku, což je v souladu s hypotézou „out-of-Africa“ (24). Ačkoli by se dalo tvrdit, že frekvence alel 7R byla zvýšena náhodně během expanze mimo Afriku, tato teorie nevysvětluje neobvyklý nedostatek diverzity afrických alel 7R. Nejčastější haplotyp L1L2-7R(1-2-6-5-2-5-4)-A-C (obr. 3) se vyskytuje ve frekvencích srovnatelných s frekvencemi zjištěnými ve světě (>85 %). Je obtížné si představit, jaký typ úzkého hrdla by mohl způsobit takové výsledky, tj. silnou celosvětovou LD pro jedinou alelu (DRD4 7R), avšak malou LD pro ostatní alely. Model, který je v souladu s pozorovanými výsledky, je hypotéza „slabé rajské zahrady“ (24), v níž by se předpokládalo, že alela DRD4 4R je stará a přítomná v původních populacích, zatímco alela 7R se rozšířila expanzí z (a do) Afriky. V takové slabé hypotéze rajské zahrady je stále nutné navrhnout pozitivní selekci pro alelu DRD4 7R.

Přestože se domníváme, že nedávný mutační původ a pozitivní selekce nejlépe vysvětlují údaje o alele DRD4 7R, nelze vyloučit ani jinou možnost. Vzhledem k vysoce nepravděpodobným rekombinačním/mutačním událostem potřebným ke vzniku alely 7R z alely 4R stojí za zvážení možnost importu této alely z blízce příbuzné hominidní linie. O tom, o jakou linii by se mohlo jednat, lze pouze spekulovat, ale v přibližné době vzniku alely 7R byly přítomny populace neandertálců. Podle tohoto modelu by pak doba koalescence alel 4R a 7R byla dávná, přičemž k importu došlo teprve nedávno, měřeno pomocí LD. Je zřejmé, že další experimentální práce mohou tyto spekulace objasnit.

U lokusu DRD4 je nepravděpodobné, že by selekce na sousední gen mohla vysvětlit navrhovanou selekci, vzhledem k odlišné a neobvyklé sekvenci DNA samotné alely DRD4 7R. Pokud alela DRD4 7R vznikla před ≈40 000 lety, můžeme se ptát, co se v té době v lidské historii odehrávalo? Je lákavé spekulovat, že velká expanze lidí, ke které v té době došlo, výskyt radikálně nové technologie (svrchní paleolit) a/nebo rozvoj zemědělství (24), by mohly souviset se zvýšením frekvence alely DRD4 7R. Možná, že expanzi (a částečné nahrazení) řídili jedinci s osobnostními rysy, jako je vyhledávání novinek, vytrvalost atd. Byla vyslovena domněnka, že za současné rozložení alel 7R může migrace (34). Kromě takového fenotypového výběru by mohl působit i výběr pohlavní. Jak původně definoval Darwin (36), „jakákoli výhoda, kterou mají někteří jedinci oproti jiným stejného pohlaví a druhu pouze s ohledem na rozmnožování“, povede ke zvýšení počtu potomků. Pokud mají jedinci s alelou DRD4 7R osobnostní/kognitivní rysy, které jim poskytují výhodu (více sexuálních partnerů, vyšší pravděpodobnost výběru partnera atd.), pak se frekvence této alely bude rychle rozšiřovat v závislosti na kulturním prostředí. Možná, že kulturní rozdíly mohou vysvětlit některé z pozorovaných rozdílů ve frekvenci alely DRD4 7R (3). Je zřejmé, že určení přesné povahy selekce DRD4 a jejího biochemického a behaviorálního základu čeká na další experimenty. Nedávné experimenty naznačující, že jedinci s ADHD a vlastnící tuto neobvyklou alelu DRD4 7R podávají normální výkony v kritických neuropsychologických testech pozornosti ve srovnání s ostatními probandy s ADHD (6), ukazují jen na jednu z mnoha oblastí budoucího zkoumání.

Lze se ptát, proč je alela, která zřejmě prošla silnou pozitivní selekcí v lidské populaci, přesto nyní neúměrně zastoupena u jedinců s diagnózou ADHD. Hypotéza běžné varianty/běžné poruchy (16) navrhuje, že běžná genetická varianta souvisí s běžným onemocněním buď proto, že onemocnění je produktem nového prostředí (takže genotypy spojené s poruchou nebyly v minulosti eliminovány), nebo má porucha malý vliv na fitness (protože se projevuje pozdě). U poruch s časným nástupem (jako je autismus, ADHD atd.) navrhujeme zabývat se možností, že predisponující alely jsou ve skutečnosti pod pozitivním výběrem a vedou ke škodlivým účinkům pouze v kombinaci s dalšími environmentálními/genetickými faktory. V této souvislosti je možné, že na tento gen již nepůsobí předchozí selekční omezení. Je však také možné spekulovat, že právě znaky, které mohou být selektovány u jedinců vlastnících alelu DRD4 7R, mohou predisponovat k chování, které je v typickém školním prostředí považováno za nevhodné, a tudíž diagnostikováno jako ADHD.

.