Cyklistika GroEL/GroES:

Výsledky

Rychlá vazba ATP na GroEL, jak ji odhalují změny intenzity fluorescence GroEL F44C značeného Oregon Green 488.

Pro sledování vazby ATP na GroEL jsme vycházeli z dříve vyrobené varianty GroEL, F44C, obsahující jediný cystein v jinak „cystein-nula“ verzi GroEL, ve které byly všechny 3 přirozené cysteiny v podjednotce GroEL (aminokyseliny 138, 458 a 519) nahrazeny alaninem (21). Jak je znázorněno na obr. 1A, F44 leží ve smyčce směřující vzhůru do centrální dutiny GroEL na úrovni ekvatoriální domény, umístěné mezi ekvatoriálními antiparalelními β-řetězci, v jejichž blízkosti se nacházejí zbytky, které prostřednictvím molekuly vody a draselného iontu tvoří vodíkové vazebné kontakty s terminálním fosfátem vázaného ATP. Smyčka a reziduum 44 jsou tedy disponovány tak, aby byly ovlivněny nepřítomností vs. přítomností ATP. Dřívější studie uváděla, že substituce F44W se může projevit na vazbě ATP (16). Zde jsme použili mutant F44C, u něhož bylo již dříve pozorováno, že je plně funkční, což naznačuje schopnost jeho kódujícího plazmidu zachránit růst mutanta s deficitem GroEL a schopnost purifikovaného proteinu provádět účinné přeložení proteinu závislé na ATP/GroES in vitro (21). F44C byl značen pomocí Oregon Green 488 (OG488)-maleimidu na úroveň ≈70% obsazení. Zůstala plně funkční při zprostředkování opětovného skládání malátdehydrogenázy (MDH) in vitro a vykazovala kinetiku téměř shodnou s kinetikou WT GroEL . Rychlost obratu ATP v ustáleném stavu u modifikovaného mutanta, nazvaného EL44-OG, se také podobala rychlosti obratu WT GroEL (obr. S1B).

Fluorescenční emisní spektra EL44-OG (excitované při 496 nm) ukázala, že přidání ATP způsobilo velký pokles intenzity fluorescence v ustáleném stavu (≈65 % při 500 μM ATP), doprovázený malým modrým posunem emisního maxima (obr. 1B). Naproti tomu ADP způsobilo menší pokles intenzity, což potvrzuje, že γ-fosfát ATP má specifický vliv na konformaci smyčky obsahující 44.

Při zastavení toku smícháním 0,5 mM ATP s EL44-OG byl pozorován rychlý pokles intenzity emise s křivkou, kterou lze napasovat jako součet dvou exponenciál, jedné s rychlostní konstantou ≈100 s-1 a druhé s rychlostní konstantou 4 s-1 (obr. 1C). První rychlost naznačuje rychlou interakci ATP s nevázaným GroEL a odpovídá rychlostem, které byly dříve popsány jak pro F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1), tak pro 2 další verze GroEL substituované tryptofanem: Y485W, kde byl tryptofan substituován na jiném místě ekvatoriální domény (ref. 16). 18; 123 ± 2 s-1) a R231W (ref. 17; 80 s-1), kde byl tryptofan substituován do dutiny směřující k apikální doméně (GroEL jinak tryptofan neobsahuje). Podle očekávání byla rychlost interakce ATP s EL44-OG závislá na koncentraci ATP (obr. 1D) a pro rychlejší fázi byla stanovena bimolekulární rychlostní konstanta 2 × 105 M-1 s-1 . Pomalejší kinetická fáze, rovněž závislá na koncentraci ATP, pravděpodobně odpovídá třetí fluorescenční fázi pozorované u R231W a Y485W GroEL při vazbě ATP (17, 18). Možnost, že tato fáze odráží hydrolýzu ATP, byla vyloučena použitím chaperoninu D398A/EL44-OG s defektem hydrolýzy.

Stejně rychlá změna fluorescence při vazbě ATP na otevřený trans kruh asymetrického komplexu GroEL/GroES/ADP.

Za fyziologických podmínek je normálním akceptorovým stavem pro ATP otevřený trans kruh asymetrického komplexu GroEL/GroES/ADP. Při míchání se zastaveným průtokem jsme pozorovali, že rychlost vazby ATP na trans kruh komplexů EL44-OG/GroES/ADP je podobná jako u nevázaného kruhu GroEL (obr. 1E, srovnej s obr. 1F). I zde existovala závislost na koncentraci ATP, která se podobala závislosti na koncentraci nevázaného EL44-OG (obr. 1D).

Substrátový polypeptid navázaný na trans-kruh neovlivňuje rychlost vazby ATP.

V řadě studií in vitro byl nenativní polypeptid nejprve komplexován na otevřený trans-kruh asymetrického komplexu ADP GroEL/GroES před přidáním ATP a přebytku GroES (8, 9). Za těchto podmínek je vazba ATP následovaná vazbou GroES zjevně schopna zapouzdřit nenativní polypeptid a usměrnit produktivní skládání. Je rychlost vazby ATP v takovém kontextu ovlivněna navázaným substrátovým proteinem? Za účelem ověření této skutečnosti byl nenativní MDH navázán na asymetrické komplexy EL44-OG/GroES/ADP a poté byl přidán ATP s mícháním se zastaveným průtokem. Za těchto podmínek byla rychlost změny intenzity fluorescence prakticky stejná jako u komplexu EL44-OG/GroES/ADP v nepřítomnosti polypeptidu (srovnej obr. 1G s obr. 1E). Přítomnost nenativního substrátu navázaného na apikální domény trans kruhu tedy nemá žádný zjistitelný vliv na rychlý vstup ATP do ekvatoriálních vazebných kapes pro nukleotidy trans kruhu.

Rapid Apical Domain Movement Accompanes ATP Binding.

Když se ATP rychle váže na GroEL, způsobuje to významné úpravy v apikálních polypeptidových vazebných doménách ve stejně rychlém časovém měřítku, nebo jsou apikální změny v reakci na vazbu ATP relativně pomalé, takže účinky vazby ATP je třeba považovat za projevující se později? Již dřívější studie R231W naznačila, že u tohoto mutanta dochází k rychlým apikálním účinkům (17). Také v této studii vykazovala fluorescenční sonda na vnější straně apikálních domén, vzdálená od vazebného místa ATP na vnitřní straně válce (GroEL E315C na pozadí nulového cysteinu značeného OG), rychlou změnu intenzity fluorescence ve stejném časovém měřítku jako vazba ATP. Například pro asymetrický komplex GroEL315-OG/GroES/ADP byla při koncentraci ATP 150 μM pozorována rychlostní konstanta 20 s-1 (obr. 1H, srovnejte s 25 s-1 na obr. 1E). K takovým apikálním změnám docházelo ve stejném prstenci, na který je vázán ATP, protože analýza verze E315C s jedním prstencem modifikovaným OG, SR315-OG, ukázala podobnou rychlost změny intenzity fluorescence (obr. 1I). Rychlost apikálního pohybu byla rovněž závislá na koncentraci ATP, přičemž rychlost byla paralelní s rychlostí vazby ATP (obr. S2, srovnej s obr. 1D).

Relativně pomalá vazba substrátového polypeptidu měřená pomocí FRET.

Abychom umožnili porovnat rychlost vazby nenativního substrátového polypeptidu s rychlostí vazby ATP, měřili jsme dále rychlost vazby substrátových proteinů na asymetrické komplexy GroEL/GroES/ADP pomocí FRET. Byly studovány tři různé substrátové proteiny: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) a dvojitě mutovaná forma proteinu vázajícího maltózu (DM-MBP; 41 kDa). Všechny tři proteiny se při 25 °C chovají jako přísné substrátové proteiny a k dosažení nativní formy vyžadují přítomnost GroEL, GroES a ATP (3). V jejich nepřítomnosti dochází ke kvantitativní agregaci. Pro sledování vazby byla měřena FRET mezi substrátovým proteinem značeným kumarin propyl maleimidem (CPM; donor) na cysteinovém zbytku (viz Materiály a metody) a EL44-OG (akceptor). Při excitaci při excitačním maximu pro CPM (384 nm) byla pořízena emisní spektra pro substráty značené CPM (donor) při vazbě na neznačený GroEL (obr. 2A, příklad DM-MBP-CPM, černá stopa), pro EL44-OG v komplexu s neznačeným substrátem (obr. 2A, značený akceptor, modrá stopa) nebo pro komplexy se substrátem značeným CPM navázaným na EL44-OG (obr. 2A, červená stopa). Jak u DM-MBP-CPM, tak u MDH-CPM došlo při asociaci s EL44-OG k silnému zhášení donoru; současně se objevil značný signál akceptoru.

Při míchání 125 nM DM-MBP-CPM se 125 nM EL44-OG se zastaveným průtokem byl pozorován pokles intenzity donorové emise s křivkou, kterou lze fitovat jako součet 2 exponenciál, jedné s rychlostní konstantou 1,33 s-1 a druhé s rychlostní konstantou 0,65 s-1 (obr. 2B). Rychlejší rychlost (k1) byla závislá na koncentraci chaperoninu (obr. 2C), ale pomalejší nikoli. Při koncentraci GroEL 125 nM (obr. 2B) je rychlost vazby substrátového polypeptidu (k1 = 1,33 s-1) 60krát pomalejší než rychlost vazby ATP (100 s-1 při 500 μM ATP; obr. 1C). Ačkoli se předpokládá, že rychlost vazby substrátu bude několikanásobně vyšší při fyziologické koncentraci GroEL 1-2 μM (obr. 2C), rychlost vazby ATP bude pravděpodobně také o něco vyšší, uvážíme-li, že fyziologická koncentrace ATP je několikamiliolární (obr. 1D). Rychlost příchodu ATP za fyziologických podmínek je tedy pravděpodobně nejméně 10krát vyšší než příchod substrátu.

V dalším testu mělo přidání ATP současně s fluorescenčně značeným DM-MBP reprodukovatelný účinek zvýšení rychlosti vazby DM-MBP (obr. 2D a tab. S2). Celkově se zdá, že fyziologické pořadí přidávání do trans kruhu zahrnuje rychlý příchod ATP následovaný pomalejším příchodem substrátového proteinu. Toto pořadí je opačné než pořadí naprogramované v nedávných studiích, kdy byl polypeptid nejprve navázán na trans kruh a poté byl přidán ATP (8, 9). Má pořadí přidávání nějaký měřitelný vliv na opětovné skládání substrátového proteinu? Abychom to ověřili, provedli jsme experimenty s pořadím přidávání a měřili obnovu nativního enzymu v podstatě za podmínek jednoho obratu.

Větší obnova nativního stavu, když se nejprve přidá ATP a poté polypeptid, ve srovnání s opačným pořadím.

Experiment s pořadím přidávání byl proveden s použitím verze GroEL s jedním kruhem, SR1, což umožnilo analýzu „jednoho kola“. Polypeptid zachycený SR1 je po navázání GroES téměř kvantitativně složen do nativní formy uvnitř dlouhodobé cis dutiny stabilního komplexu SR1/GroES (10, 11). Proto mohl být SR1 inkubován s ATP a nenativním polypeptidem v libovolném pořadí, po kterém následoval přídavek GroES, a rozsah obnovy nativního proteinu mohl být měřen jak v závislosti na pořadí přídavku, tak na intervalu mezi přídavky (obr. 3A). Při těchto testech byl GroES přidán 2 s po ATP/polypeptidu, aby bylo možné dokončit počáteční interakce. V prvním experimentu jsme reprodukovatelně pozorovali, že když bylo nejprve přidáno nenativní Rubisco a po 2 s ATP, rozsah obnovy Rubisco v nativní formě byl pouze ≈30 %. V porovnání s >60% obnovou, když bylo nejprve přidáno ATP, a s ≈70% obnovou pozorovanou při přidání ATP a GroES k předem vytvořenému binárnímu komplexu Rubisco-SR1 (vzniklému 10minutovou inkubací nenativního Rubisco se SR1). To naznačuje, že v kontextu cyklické reakce, při níž je trans kruh akceptorového komplexu GroEL/GroES/ADP otevřený a dostupný pro vazbu polypeptidu pouze ≈1-2 s, než se GroES naváže, mobilizace jeho apikálních domén rychlou vazbou ATP podporuje vazbu nenativního polypeptidu. Opačné pořadí, tedy přidání polypeptidu 2 s před přidáním ATP, se zdálo být pro vazbu méně příznivé, přestože apikální domény mobilizované ATP byly následně k dispozici 2 s před přidáním GroES. Pozoruhodné je, že když byl interval mezi přidáním Rubisco a ATP prodloužen na 4 s (obr. 3A), efekt pořadí přidání se zmírnil, přičemž kinetika a rozsah zotavení se nyní rovnaly kinetice a rozsahu zotavení při prvním přidání ATP, což je pravděpodobně funkcí rozsáhlejší vazby polypeptidu během intervalu před přidáním ATP. Ačkoli byl rozsah obnovy Rubisco ve studiích s pořadím přidání s intervalem 2 s významně ovlivněn, kinetika obnovy nativního stavu uvnitř stabilních komplexů SR1/GroES byla podobná, což odpovídá vlivu na vazbu substrátového proteinu, nikoli na rychlost skládání v zapouzdřené komoře.

Rozsáhlejší vazba Rubisco s nejprve přidaným ATP.

Pro řešení vlivu pořadí přidávání na vazbu substrátového proteinu jsme použili 35S značené Rubisco a měřili množství, které se navázalo na SR1 během inkubace s pořadím přidávání, pomocí gelové filtrace směsí konečných produktů k oddělení stabilních komplexů SR1/GroES/Rubisco od nenavázaného polypeptidu. To ukázalo, že ≈10 000 cpm 35S-Rubisco se navázalo, když bylo 40 000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) přidáno 2 s před ATP, a že ≈30 000 cpm se navázalo, když bylo ATP přidáno 2 s před Rubisco (obr. 3B). Posledně uvedeného rozsahu vazby bylo dosaženo také při následné společné inkubaci binárních komplexů SR1-Rubisco vytvořených po dobu 10 min s ATP a GroES (obr. 3B). Tato měření rozsahu vazby substrátu jsou tedy paralelní s rozsahem obnovení enzymatické aktivity (srovnej obr. 3B s obr. 3A) a podporují závěr, že v kontextu 2sekundového intervalu mezi přidáním ATP/polypeptidu přídavek ATP zpočátku upřednostňuje účinnější vazbu substrátového proteinu.

Větší míra vazby Rubisco na ATP exponovaný chaperoninový kruh

Výše uvedené pozorování většího rozsahu vazby Rubisco v experimentu s pořadím přidávání, při kterém se zpočátku přidává ATP, naznačuje, že míra asociace Rubisco s ATP mobilizovanými apikálními doménami může být větší. K ověření této skutečnosti byla použita verze SR1 s ATP hydrolýzou defektní D398A s OG navázaným na cystein substituovaný v poloze 44 (na pozadí C138A), u které byla pomocí FRET zjištěna rychlost vazby Rubisco značeného CPM (obr. 3 C-E). Pozorovali jsme, že rychlost vazby Rubisco, provedená za stejných podmínek jako výše uvedené experimenty s pořadím přidávání, byla 2krát vyšší v přítomnosti oproti nepřítomnosti ATP (srovnej obr. 3D s obr. 3C). Při současném přidání ATP a nenativního Rubisco, což odráží fyziologickou situaci, se rychlost vazby Rubisco podobala rychlosti, kdy bylo ATP přidáno před Rubisco (obr. 3E, srovnej s obr. 3D). Tyto údaje potvrzují, že Rubisco se rychleji spojuje s prstencem, jehož apikální domény byly mobilizovány ATP, a že za fyziologických podmínek, kdy je přítomen jak ATP, tak nenativní substrát, jsou to právě apikální domény mobilizované ATP, které působí při vazbě substrátu.

.