Indikace širokého rozsahu 16S rDNA PCR
Široký rozsah 16S rDNA PCR může detekovat životaschopné i neživotaschopné bakterie, podobně jako qPCR. Je také klinicky užitečná v případech, kdy jiné techniky poskytují negativní výsledky, například u kultivačně negativní endokarditidy, septické artritidy, meningitidy nebo infekcí dlouhého vedení.8 11 Identifikované bakterie jsou často neobvyklé, vzácné, obtížně kultivovatelné nebo bakterie, pro které není k dispozici specifická PCR.8 9 Příkladem může být identifikace Helicobacter sp jako základní příčiny osteomyelitidy nebo Neisseria meningitidis jako neočekávané příčiny septické artritidy pomocí PCR s širokým rozsahem 16S rDNA poté, co byly výsledky jiných mikrobiálních diagnostických technik negativní.12 13
Je také možné rozlišovat mezi druhy: Ureaplasma spp se skládá ze dvou bakteriálních kmenů, Ureaplasma parvum a Ureaplasma urealyticum, které jsou kultivačně nerozlišitelné a u každého z nich se předpokládá, že způsobuje jinou patologii u novorozenců.7 14 15 PCR s širokým rozsahem 16S rDNA s následným sekvenováním umožnila rozlišení a identifikaci obou druhů, což napomáhá výzkumu druhově specifické patogenity.8 16
Přídavně může PCR s širokým rozsahem 16S rDNA identifikovat dosud necharakterizované bakterie. PCR s širokým rozsahem 16S rDNA umožnila identifikovat Bartonella henselae a Tropheryma whippelii jako patogeny, které jsou základem nemoci kočičího škrábnutí, respektive Whippleovy nemoci.17 18
Široký rozsah PCR s širokým rozsahem 16S rDNA ji však činí náchylnou ke kontaminaci. Amplifikuje se veškerá bakteriální DNA přítomná ve vzorku, včetně té, která je nevyhnutelně přítomna v činidlech, což znamená, že nízkou kontaminaci prostředí nelze zcela vyloučit. Při vysokém počtu tepelných cyklů bude tato nízká kontaminující DNA na pozadí amplifikována a poskytne falešně pozitivní výsledek. Aby se toto riziko snížilo, musí se sekvenování provádět tak, aby se rozlišilo mezi skutečným patogenem a kontaminanty (často bakteriemi přenášenými vodou, u nichž je velmi nepravděpodobné, že by způsobily onemocnění). Pomocí standardních sekvenačních technik lze identifikovat pouze nejdominantnější sekvenci DNA, což znamená, že ve vzorcích, kde je přítomen více než jeden bakteriální druh (např. ve stolici), jsou výsledky neinterpretovatelné. To znamená, že širokorozsahová 16S rDNA PCR se standardním sekvenováním není užitečná pro vzorky z nesterilních míst.
Pro další snížení rizika zahlcení kontaminací je počet tepelných cyklů ve srovnání se specifickými qPCR snížen, což má však současně za následek snížení citlivosti.19 To znamená, že širokorozsahová 16S rDNA PCR bude vždy méně citlivá než dobře navržená specifická qPCR v řádu 1-2 log. Poslední nevýhodou je, že tyto metody mohou být omezeny na výzkumné nebo specializované laboratoře, což znamená, že vzorky mohou být odeslány, což prodlužuje dobu zpracování.16 Srovnání hlavních výhod a nevýhod kultivačních metod, qPCR a širokospektrální 16S rDNA PCR je uvedeno v tabulce 1 a vývojový diagram navrhovaných vyšetření při podezření na bakteriální infekce sterilních míst zahrnující qPCR i širokospektrální 16S rDNA PCR je na obrázku 1C.
Shrnuto, PCR širokého rozsahu 16S rDNA je důležitým doplňkem mikrobiologické diagnostiky jako druhá linie v případě, že existuje velké podezření na infekci sterilního místa, ale kultivace a qPCR pro nejpravděpodobnější patogeny byly prokázány jako negativní. Vzhledem k riziku detekce kontaminace bakteriální DNA se provádí méně cyklů PCR než u qPCR, což má za následek nižší citlivost testu, proto by se měla nejprve použít qPCR (obrázek 1C). Ve výzkumu se bude 16S rDNA PCR nadále používat k identifikaci nových bakteriálních druhů, k charakterizaci druhově specifické patogenity a jako zlatý standard pro porovnání při hodnocení nových testů. Používá se také v kombinaci s nejmodernějšími technikami, jako je sekvenování nové generace. To se používá k charakterizaci komplexních mikrobiálních populací ve střevech, stolici, vagíně, placentě, plicích a v životním prostředí.20 Vzhledem k tomu, že sekvenování nové generace založené na PCR s širokým rozsahem 16S rDNA se stává cenově dostupnějším a rozšířenějším, mají tyto techniky potenciál umožnit terapii na míru, protože se zvyšuje naše porozumění komplexní interakci mezi námi a našimi mikrobiálními komunitami.21 Širokorozsahová PCR 16S rDNA mikrobiálních střevních společenstev například identifikovala odlišné změny u stavů, jako je HIV, po předčasném porodu novorozenců a podvýživa.22-24 Jak budeme zkoumat potenciální terapeutické cesty odhalené u těchto rozmanitých stavů, je pravděpodobné, že širokorozsahová PCR 16S rDNA bude základním kamenem dalšího výzkumu.