Co je sekvenování v reálném čase s jednou molekulou (SMRT)?

By Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Reviewed by Christian Zerfaß, Ph.D.

Přejít na:

• Jak funguje sekvenování SMRT?
• Studium metylace DNA u bakterií; aplikace sekvenování SMRT

Sekvenování DNA funguje tak, že se pomocí DNA polymerázy přidávají nukleotidy k templátu. Pro sekvenování DNA je k dispozici několik technologií. Jedním z nich je například sekvenování v reálném čase s jednou molekulou neboli sekvenování SMRT.

Výzkumník zkoumá průhledové sklíčko sekvence DNA. Credit: Shawn Hempel /

Jak funguje sekvenování SMRT?“

Stejně jako u jiných technologií sekvenování DNA je prvním krokem po extrakci DNA příprava „knihovny“. Tímto procesem se DNA připraví na sekvenování; v tomto případě se na oba konce dvouvláknové molekuly DNA přidají adaptory, čímž se z DNA účinně stane jednovláknová kruhová předloha. To pak znamená, že DNA lze sekvenovat kontinuálně.

Tato knihovna DNA neboli templátová DNA se pak vloží do sekvenátoru DNA, který obsahuje „vlnovody s nulovým režimem“, na jejichž jednom konci je imobilizována DNA polymeráza. Do těchto nulových vlnovodů se pak imobilizuje jedna molekula DNA a DNA polymeráza začne přidávat nové nukleotidy do de novo syntetizovaného vlákna DNA komplementárního k templátové DNA. Báze v těchto nukleotidech jsou označeny a začlenění těchto bází do rostoucího vlákna DNA způsobí emisi světla. Tato světelná emise je pak čtena v reálném čase, a protože emise z každé báze je jiná, umožňuje to identifikovat konkrétní bázi.

Hlavní výhodou sekvenování SMRT je generování dlouhých sekvenačních čtení s vysokou přesností, což zlepšuje sestavování celých genomů. Delší sekvenační čtení totiž znamenají, že k sestavení genomu je zapotřebí méně „staveb“.

Studium metylace DNA u bakterií; aplikace sekvenování SMRT

Co je to metylace DNA?

Přidávání metylové skupiny do DNA, známé také jako metylace, se vyskytuje ve všech říších života. U bakterií se vyskytují tři metylované nukleotidy: m5C (C5-metyl-cytosin, který se vyskytuje i u eukaryot), m6A (N6-metyl-adenin) a m4C (N4-metyl-cytosin, který se vyskytuje pouze u bakterií). K metylaci dochází po syntéze nových řetězců DNA a děje se na určitých nukleotidech.

Methylové skupiny vyčnívají z dvojité šroubovice DNA, a proto mohou ovlivnit vazbu mezi DNA a vazebnými proteiny DNA. To následně ovlivňuje procesy včetně replikace chromozomů, opravy chyb v DNA a také načasování transkripce genů a tvorbu epigenetických linií.

Epigenetické mechanismy: metylace nebo acetylace dna může aktivovat či neaktivovat transkripci genů. Image Credit: ellepigrafica /

Proč je metylace DNA u bakterií důležitá?“

Bakterie jsou infikovány viry, proto potřebují ochranný mechanismus k překonání virových infekcí. Zde přicházejí ke slovu restrikčně-modifikační systémy; tento systém se skládá z restrikčního enzymu, který rozkládá DNA na určitých místech, a DNA metyltransferázy, která přidává metylovou skupinu k adeninu (A) nebo cytosinu (C).

Ve většině restrikčně-modifikačních systémů působí DNA metyltransferáza jako ochrana bakteriální DNA před restrikčním enzymem. Přítomnost metyltransferázy DNA znamená, že bakteriální DNA se metyluje, zatímco infikující virová DNA nikoli. To zase znamená, že virová DNA je degradována restrikčním enzymem, zatímco bakteriální DNA je chráněna, protože restrikční enzym nepůsobí na metylovanou DNA. Je však třeba poznamenat, že existují restrikční enzymy, které působí na modifikovanou DNA.

Nedávné studie naznačily, že restrikčně-modifikační systémy mohou mít další role. Například vyřazení některých restrikčně-modifikačních systémů vedlo ke změně genové exprese, která souvisí s rozdílem v metylaci DNA. Restrikčně-modifikační systémy mohou také způsobovat dvouřetězcové zlomy a C-T mutace, a tím ovlivňovat evoluci bakterií. V poslední době byly vyvinuty technologie, které jsou schopny určit metylaci celého bakteriálního genomu, známou jako „metylom“.

Jak se určuje metylom pomocí sekvenování SMRT?

Jelikož sekvenování SMRT poskytuje výsledky v reálném čase, lze jej použít k detekci modifikací DNA včetně metylací. Polymeráza DNA inkorporuje nukleotidy konstantní rychlostí, ale tato rychlost se může změnit, pokud byl nukleotid v templátu modifikován. To lze zaznamenat během procesu sekvenování.

Blow at al. použil sekvenování SMRT k mapování modifikací DNA u 230 mikroorganismů. Mezi modifikace, které hledali, patřily m5C, m6A a m4C. Autoři zjistili, že 93 % těchto mikroorganismů vykazovalo metylaci DNA, a našli také 834 motivů, které byly metylované. To autorům umožnilo určit, které motivy jsou cílem pro 620 DNA metyltransferáz.

Zajímavé je, že autoři si všimli, že zatímco 48 % zkoumaných organismů mělo DNA metyltransferázu, nebylo prokázáno, že by byl přítomen také restrikční enzym. Je tedy možné, že metylace DNA hraje důležitou roli v regulaci genomu nebo jinou důležitou roli u mikroorganismů, která ještě nebyla identifikována.

Další čtení

• Všechen obsah sekvenování DNA
• Sekvenování DNA
• Sestavování sekvencí DNA
• Mikroarray DNA
• Vysokokapacitní techniky sekvenování DNA

Napsal

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama je vědecký pracovník a autor vědeckých článků. Doktorát získala na univerzitě v Bathu ve Velké Británii na základě disertační práce v oboru mikrobiologie, kde aplikovala funkční genomiku na Staphylococcus aureus . Během doktorského studia Maho spolupracovala s dalšími vědeckými pracovníky na několika pracích a některé své vlastní práce dokonce publikovala v recenzovaných vědeckých časopisech. Svou práci také prezentovala na vědeckých konferencích po celém světě.

Citace

.