RECEPTOR
Receptor erytropoetinu byl klonován expresní strategií z cDNA knihovny myších erytropoetinových buněk (D’Andrea et al., 1989). Lidský gen pro receptor erytropoetinu je lokalizován na chromozomu 19p (Winkelman et al., 1990). Má osm exonů a sedm intronů a kóduje peptid o 507 aminokyselinách a molekulové hmotnosti 66 kDa. V lidském genu exony 1-5 kódují extracelulární doménu o 251 aminokyselinách, exon 6 membránovou a-helikální oblast o 20 aminokyselinách a exony 7-8 cytoplazmatickou doménu o 236 aminokyselinách (Youssoufian et al., 1993). Lidský erytropoetinový receptor nemá žádná N-vázaná glykosylační místa, ale vysokou frekvenci serinových a threoninových zbytků (Jones et al., 1990). Mezi lidským a myším erytropoetinem je 82% identita. Zesíťování erytropoetinu na buněčném povrchu erytroidních buněk odhalilo dvě akcesorní molekuly o velikosti 85 a 100 kDa, které nejsou rozpoznávány protilátkami anti-p66 (D’Andrea a Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Jejich funkci je však třeba určit.
Receptor pro erytropoetin patří do rodiny jednotransmembránových cytokinových receptorů typu 1. Receptory pro erytropoetin se vyskytují ve všech oblastech. Tato rodina sdílí konzervovanou extracelulární doménu složenou ze subdomén fibronektinu typu III (FNIII) a také konzervovaný motiv α-řetězce cytoplazmatického boxu 1, který se selektivně váže na Janusovy kinázy (JAK) (Bazan, 1990b). Extracelulární oblast erytropoetinového receptoru obsahuje dvě subdomény FNIII (D1 a D2), které tvoří tvar písmene L, přičemž dlouhá osa každé domény je zarovnána přibližně pod úhlem 90° k druhé ose. NH2-koncová doména D1 se skládá ze čtyř na čtyři a-řetězce a doména D2 ze sedmi aniparalelních a-řetězců (Livnah et al., 1996). Doména D1 tvoří záhyb typu h s hybridní topologií podobnou FNIII/imunoglobinu a dva distální páry cysteinových zbytků tvoří disulfidové můstky. Membránová proximální doména D2 se skládá se standardní topologií typu s FNIII a obsahuje konzervovaný motiv WSXWS (tj. tryptofan-serin-jakákoli aminokyselina-tryptofan-serin), který je důležitý pro skládání erytropoetinového receptoru (Quelle a kol., 1992). Domény D1 a D2 přispívají společně šesti smyčkami k interakci erytropoetinu. Cytoplazmatická oblast, která je bohatá na aminokyseliny prolin, glutamin a aspartas, obsahuje doménu box 1 (zbytky 257-264), která je specifická pro JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al., 1996), doménu box 2 (zbytky 303-313) a osm fosfotyrosinových míst (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479), která zprostředkovávají nábor efektorů kódujících doménu Src homology-2 (SH2). Rozšířený box2 (zbytky 329-372) je nezbytný pro vazbu tyrozinkinázového receptoru KIT po aktivaci jeho ligandem a způsobuje tyrozinovou fosforylaci receptoru erytropoetinu, což naznačuje funkční interakci mezi oběma receptory (Wu et al., 1995a). Erytropoetin aktivuje erytropoetinový receptor dimerizací (Philo et al., 1996). Jedna molekula p66 váže erytropoetin s vysokou afinitou (Kd kolem 1 nM), druhá s nižší afinitou (Kd kolem 2 μM). Pomocí mutací a delecí byla zmapována aktivní místa erytropoetinu (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Bivalentní, ale nikoli monovalentní monoklonální protilátky namířené proti extracelulární doméně receptoru erytropoetinu vyvolávají proliferaci buněčných linií závislých na erytropoetinu a tvorbu BFU-E, což naznačuje aktivaci receptoru prostřednictvím jeho dimerizace (Elliot et al., 1996). Stejného účinku lze dosáhnout použitím malých mimetických peptidů erytropoetinu (EMP) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Přestože EMP nemají s erytropoetinem žádnou sekvenční homologii, vážou se specificky na erytropoetinový receptor. Bodové mutace v extracelulární doméně (R129C, E132C nebo E133C) vytvářejí disulfidové vazby a konstitutivně také aktivují receptor (Watowich et al., 1994). Zejména mutace argininového zbytku 129 na cystein je onkogenní a vyvolává erytroleukémii (Longmore a Lodish, 1991). Naopak EMP33 je schopen dimerizovat, ale ne aktivovat receptor, což naznačuje zásadní roli konformační změny v dimerizovaném receptoru pro jeho signalizaci (Livnah a kol., 1998; Remy a kol., 1999). Byla navržena existence předem vytvořených neaktivních dimerů receptoru na povrchu buňky, která je zprostředkována intervenčními oblastmi D1-D2 a zajišťuje oddělení 79 A na bázi jejich extracelulárních domén (Livnah et al., 1996). Po navázání agonisty mění extracelulární receptorové domény svou strukturu v definované orientaci s rozestupem 39 Å, což zajišťuje úpravu jejich cytoplazmatických složek a vede k signalizaci (Wilson a Jolliffe, 1999).
Kromě vazby erytropoetinu může být erytropoetinový receptor aktivován dalšími mechanismy. Obalový protein gp55 kódovaný myším virem Friend vyvolává u myší erytroleukémii poté, co se naváže na myší erytropoetinový receptor a aktivuje jej (Wolff a Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Kromě toho jsou syntetické peptidy, které nemají žádnou sekvenční homologii s erytropoetinem, schopny stimulovat erytropoetinový receptor (viz níže).
.