Bookshelf

Corrective factors and recognition signals

Modelový systém pro enzymovou substituční terapii vznikl na základě studií kultivovaných kožních fibroblastů získaných od pacientů s mukopolysacharidovými střádavými chorobami (MPS). Tyto fibroblasty vykazovaly nadměrnou akumulaci glykosaminoglykanů, která byla interpretována jako důsledek nedostatečné degradace těchto makromolekul . Náhodou bylo zjištěno, že směs fibroblastů odvozených od pacientů s MPS I (Hurlerův syndrom) a MPS II (Hunterův syndrom) má normální vzorec metabolismu glykosaminoglykanů (obrázek 1) . Bylo známo, že obě onemocnění jsou geneticky odlišná , MPS I se dědí autozomálně recesivním způsobem a MPS II je porucha vázaná na chromozom X, což vedlo Fratantoniho a spol. k hypotéze, že fibroblasty různých genotypů si navzájem poskytují chybějící genový produkt. Další studie ukázaly, že pro takovou křížovou korekci není nutné, aby geneticky odlišné buňky byly ve vzájemném kontaktu, protože médium podmíněné jednou z nich může být korekční pro druhou. Strategii křížové korekce by bylo možné rozšířit i na příbuzné choroby – buňky, které se vzájemně korigovaly, by měly odlišný genotyp, zatímco buňky, které se vzájemně nekorigovaly, by měly stejný genotyp (viz však důležitá výjimka níže).

Jelikož Hurlerův syndrom byl postulován jako lysozomální střádavé onemocnění na základě pozorování dramaticky zduřelých jaterních lysozomů u postižených pacientů , Fratantoni a spol. předpokládali, že „korekční faktory“ v podmíněném médiu by mohly být lysozomální enzymy, které byly vylučovány jednou buněčnou linií a endocytovány druhou. Korekční faktory však neodpovídaly žádnému tehdy známému lysozomálnímu enzymu (tato situace se změnila o několik let později, kdy byl objeven MPS s deficitem β-glukuronidázy ). Purifikace Hurlerových a Hunterových korekčních faktorů byla provedena nikoli z kondicionovaného média, ale z moči, tělesné tekutiny relativně bohaté na lysozomální enzymy. Funkce byla purifikovaným faktorům přiřazena pomocí různých biochemických metod, což vedlo k tomu, že Hurlerův a Hunterův korekční faktor byly pojmenovány α-l-iduronidáza a iduronátsulfatáza .

Buňky, které potřebovaly Hurlerův korekční faktor k normalizaci svého glykosaminoglykanového metabolismu (od pacientů s Hurlerovým syndromem a se Scheieho syndromem ), měly rovněž nedostatek aktivity α-l-iduronidázy ). Korekce Hurlerových fibroblastů byla doprovázena vychytáváním α-l-iduronidázy. Jako dobrá předzvěst pro enzymovou substituční terapii bylo vychytávání pozoruhodně účinné a k zajištění úplné korekce bylo třeba internalizovat pouze velmi malé množství α-l-iduronidázy.

Tím by to mohlo skončit, nebýt malého rozporu ve vzorci eluce enzymatické aktivity a korekční aktivity z hydroxyapatitové kolony , což naznačuje, že obě aktivity Hurlerova korekčního faktoru nebyly přesně identické. V návaznosti na tuto diskrepanci Shapiro a kol. rozdělili α-l-iduronidázu na korekční a nekorekční frakce na koloně heparin-sefarosy, což naznačuje, že korekční faktor má nějakou vlastnost, která není nutná pro katalytickou aktivitu, ale je nutná pro absorpci. Podobně bylo nalezeno více forem β-glukuronidázy, které se lišily vychytáváním a korekční aktivitou .

Existenci specifického signálu pro vychytávání lysozomálního enzymu naznačily výsledky studie nově objeveného onemocnění podobného MPS – nazvaného nemoc inkluzních buněk (I-buněčná nemoc) kvůli nápadným fázově hustým inkluzím v kultivovaných fibroblastech . Zatímco tyto fibroblasty měly mnohočetný nedostatek lysozomálních enzymů, médium, které je obklopovalo, obsahovalo velký nadbytek lysozomálních enzymů . Enzymy vylučované fibroblasty s I-buněčnou chorobou však nebyly endocytovány jinými buňkami a nebyly korigovány; pravděpodobně jim chyběl signál pro vychytávání do lysozomů . Vzhledem k tomu, že tímto defektem jediného genu byla postižena řada lysozomálních enzymů (onemocnění I-buněk se dědí autozomálně recesivním způsobem), byl signál postulován jako posttranslační modifikace proteinů enzymů. Dále bylo postulováno, že je sacharidové povahy, protože jej lze zničit mírným ošetřením periodátem . Koncepce rozpoznávacího systému založeného na sacharidech byla silně ovlivněna objevy Ashwella a jeho kolegů týkajícími se úlohy sacharidů při vychytávání cirkulujících glykoproteinů játry .

Přítomnost specifického rozpoznávacího signálu naznačovala saturovatelný, receptorem zprostředkovaný proces a naznačovala, že vychytávání lysozomálních enzymů se bude řídit Michaelis-Mentenovou kinetikou. Předpokládalo se, že analogy rozpoznávacích signálů se budou chovat jako kompetitivní inhibitory vychytávání. Toto očekávání bylo zkoumáno prostřednictvím vychytávání α-l-iduronidázy a β-glukuronidázy odpovídajícími deficientními fibroblasty. Objev Kaplana a spol., že nejlepším inhibitorem vychytávání β-glukuronidázy je mannosa-6-fosfát (M6P), a jejich předpoklad, že M6P je (nebo je součástí) dlouho hledaného rozpoznávacího signálu, byl překvapivý, protože dříve nebyl na savčích glykoproteinech zaznamenán žádný fosforylovaný sacharid. Byl okamžitě potvrzen pro vychytávání α-l-iduronidázy a dalších lysozomálních enzymů pomocí různých biochemických metod ; konečný důkaz přinesla strukturní analýza fosforylovaných sacharidových skupin . Ukázalo se, že signál objevený prostřednictvím endocytózy je také signálem pro zacílení vznikajících hydroláz do lysozomů .

Ukázalo se, že defekt u onemocnění I-buněk, který brání buňkám syntetizovat rozpoznávací signál M6P, je nedostatkem prvního ze dvou enzymů podílejících se na syntéze signálu M6P . Byly objeveny dva receptory pro M6P; chemie a biologie receptorů M6P a jejich úloha v buněčném obchodu se staly širokou a velmi aktivní oblastí buněčné biologie . Tato témata jsou předmětem mnoha přehledů, včetně kapitol 3 a 5 tohoto svazku. Význam systému M6P pro enzymovou substituční terapii bude diskutován níže.

Souběžně s těmito studiemi na kultivovaných fibroblastech vedl systém in-vivo k objevu dalšího signálu pro vychytávání lysozomálních enzymů. Bylo zjištěno, že několik lysozomálních enzymů, podaných intravenózně potkanům, se rychle vyloučí z oběhu; přetrvávaly však mnohem déle, pokud byly předem ošetřeny periodátem nebo pokud byly současně podány s agalaktoglykoproteinem . Opět se předpokládalo, že sacharidy poskytují signály pro specifické rozpoznávání. V tomto případě byla klíčovým cukrem pro rozpoznání manóza a vychytávání probíhalo v retikuloendoteliálních buňkách jater. Bylo prokázáno, že na povrchu makrofágů se vyskytuje manózový receptor, který rozpoznává N-acetylglukosamin a l-fukózu i manózu . Historicky je zajímavé, že pokusy s vychytáváním invertázy, které se významně objevily v původním návrhu enzymové substituční terapie (viz výše ), byly úspěšné, protože invertáza je glykoprotein s mannanovými řetězci, které jsou rozpoznávány manózovým receptorem .

.