Biochemické a patogenní vlastnosti řas Shewanella a Shewanella putrefaciens

VÝSLEDKY

Biotypizace izolátů Shewanella podle dvou různých schémat poskytla podobné výsledky (tabulka1). Většina klinických izolátů (74 %) patřila k biovaru 2 Gilardi (CDC biotyp 2), přičemž byly negativní na sacharózu a maltózu při růstu na SS agaru a na médiích obsahujících vysoké koncentrace NaCl. Jediný významný rozdíl zaznamenaný mezi Gilardiho klasifikačním schématem (6) a klasifikačním schématem Weyanta et al. (22) spočíval v tom, že izoláty biovaru 3 (sacharóza, maltóza, SS a NaCl negativní) nebyly zařazeny do skupiny podle biotypizačního systému CDC. Na rozdíl od lidských izolátů převažoval mezi nehumánními kmeny biovar 1 (CDC biotyp 1) (67 %). Tyto kmeny obvykle produkovaly kyselinu z maltózy a/nebo sacharózy a nerostly na agaru s vysokým obsahem soli nebo na SS agaru. Na základě nedávných taxonomických návrhů Nozueho a dalších (15) by kmeny biovaru 2 (CDC biotyp 2) byly identifikovány jako S. alga, zatímco všechny kmeny biovaru 1 (CDC biotyp 1) a 6 ze 7 kmenů biovaru 3 by byly označeny jako S. putrefaciens; zbývající kmen biovaru 3 byl následně identifikován jako S. alga. Klinicky bylo zjištěno, že převažuje S. alga (77 %), zatímco většina nehumánních izolátů (89 %) byla potvrzena jako S. putrefaciens (tabulka 1).

Všech 10 izolátů Shewanella bylo při testování na systémech API 20E, API NFT, RapID NF Plus a Vitek identifikováno jakoS. putrefaciens, s jednou výjimkou. Čtyři z pěti izolátůS. putrefaciens poskytly nepřijatelná profilová čísla na systému API 20E (č. 0602026 a 0602006); pátý kmen vytvořil vzácné číslo biotypu S. putrefaciens. Všechny kmeny S. alga poskytly vynikající identifikaci jako S. putrefaciens na API 20E. Systém API NFT identifikoval všech 10 izolátůShewanella jako S. putrefaciens s dobrou až vynikající identifikací, s jednou výjimkou, rovněž kmenem S. putrefaciens (nízká diskriminační hodnota, 48 h). Systém RapID NF Plus identifikoval všech 10 izolátů Shewanella jako S. putrefaciens s 99,9% přesností. Podobně všechny kmeny identifikoval Vitek (s přesností 97 až 99 %) jako S. putrefaciens, ačkoli tři kmeny S. putrefaciens vyžadovaly před konečnou identifikací 5 až 9 h inkubace, na rozdíl od 4h výsledků u ostatních 7 kmenů. Sacharidové reakce (arabinóza a maltóza) na systémech API 20E, API NFT a Vitek však umožňují správné přiřazení většiny kmenů k příslušným taxonům (S. putrefaciens aS. alga), pokud jsou odečteny ručně po konečné identifikaci jako S. putrefaciens.

Srovnání biochemických a enzymatických vlastností druhůShewanella odhalilo řadu rozdílů (tabulka 2). Hemolýza na ovčím krevním agaru, jak uvádí Nozue et al. (15), byla zjištěna u všech kmenůS. alga, ale pouze u několika izolátůS. putrefaciens. Většina kmenů S. alga vykazovala tento fenotyp až po delší inkubaci (48 až 72 h) a oblast hemolýzy byla často nepravidelná a obtížně zjistitelná. Potvrdily se další dříve zjištěné aktivity, které napomáhají oddělení S. alga a S. putrefaciens, jako je růst při 42 °C, růst na médiích obsahujících vysoké koncentrace soli (6,5 %) a produkce kyseliny z l-arabinózy, sacharózy a maltózy. Zjistili jsme podstatně větší počet kmenů S. putrefaciens, které rostly na SS agaru, než bylo dříve uváděno; většina z nich pocházela z jiných než humánních zdrojů. S výjimkou ribózy byla produkce kyselin z oxidace sacharidů spojena výhradně se S. putrefaciens. Cukerné vzorce se však mezi těmito izoláty značně lišily, přičemž některé byly pozitivní na arabinózu, maltózu a sacharózu, zatímco jiné byly pozitivní pouze na maltózu nebo byly asacharolytické (kmeny biovaru 3). U vybraných izolátů Shewanella bylo zjištěno několik nových enzymatických aktivit, které podle našich znalostí nebyly dříve zaznamenány. Patřily mezi ně tyrosináza, alkylsulfatáza, chitináza a elastáza (tabulka 2); většina těchto enzymů byla zjištěna u nehumánních izolátůS. putrefaciens. Většina kmenů S. alga aS. putrefaciens produkovala siderofor, jak bylo stanoveno pomocí testů Chrome Azurol S. Tato aktivita byla slabá a pět izolátů (tři izoláty S. alga a dva izoláty S. putrefaciens) na tomto médiu nerostlo.

Vybrané izoláty Shewanella, které dobře rostly při 35 °C, byly dále charakterizovány z hlediska enzymatické aktivity pomocí API-ZYM (tabulka 3) a profilů buněčných mastných kyselin pomocí systému MIDI. Z devíti substrátů napadaných jedním nebo oběma druhy rodu Shewanella pomocí API-ZYM byly vyšší celkové aktivity pro sedm z těchto enzymů spojeny s řasou S.. Jedinou aktivitou, která byla zjištěna jako silnější u S. putrefaciens, byla valin arylamidáza, ačkoli tato aktivita byla i u těchto kmenů velmi slabá. Oba druhy produkovaly shodně silnou aktivitu alkalické fosfatázy. Dalším zjištěním bylo, že všechny kmeny S. alga produkovaly shodně osm z těchto devíti enzymů, jedinou výjimkou byla valin arylamidáza. Naproti tomu S. putrefaciens byl heterogennější, přičemž čtyři z devíti zjištěných enzymů nebyly univerzálně přítomny u všech izolátů. Analýza kmenů 14Shewanella ukázala, že převládajícími mastnými kyselinami byly i-15:0, 17:1ω8c a 16:0; některé kmeny produkovaly velké množství 16:1ω7c (9 až 18 %), zatímco jiné produkovaly zanedbatelné množství. Zatímco většina vrcholů mastných kyselin byla mezi testovanými kmeny S. alga a S. putrefaciens poměrně shodná, bylo zaznamenáno několik rozdílů (tabulka4). Vyšší průměrné hodnoty kyseliny pentadekanové a cis-9-heptadekanové (17:1ω8c) byly zaznamenány u S. alga, zatímco u S. putrefaciens tomu bylo naopak, pokud jde o kyseliny hexadekanovou a dodekanovou. V případě kyseliny hexadekanové se celkový rozsah mastných kyselin mezi S. alga a S. putrefaciens nepřekrýval; v případě kyseliny pentadekanové a 17:1ω8c pouze jeden izolát S. putrefaciens nebo S. alga poskytl hodnotu, která spadala do rozsahu toho druhého. Ačkoli žádný jednotlivý pík nebyl diagnostický, použití všech čtyř píků dohromady jasně rozdělilo 14 kmenů rodu Shewanella do dvou skupin podle druhových linií.

Zjistilo se, že 23 kmenů S. putrefaciensby bylo možné rozdělit do tří samostatných skupin na základě několika fenotypových charakteristik (tabulka 5). Skupina 1, kterou tvořilo osm kmenů včetně ATCC 8073, produkovala kyselinu z maltózy, sacharózy a arabinózy a využívala kyselinu urokanovou. Kmeny skupiny 1 byly rovnoměrně rozděleny mezi klinické a nehumánní izoláty. Kmeny skupiny 2 (n = 6), mezi něž patřil ATCC 8071, se od kmenů skupiny 1 lišily především neschopností oxidovat sacharózu a maltózu. Polovina těchto kmenů opět pocházela z klinického materiálu. Kmeny skupiny 3 (n = 9), všechny environmentálního původu (oblast Michiganského jezera), se od skupin 1 a 2 dramaticky lišily. Rostly špatně nebo nerostly při 35 °C, produkovaly chitinázu a nepigmentovaly na kryptofanovém agaru. Všech devět kmenů skupiny 3 zpočátku produkovalo α-glukosidázu, ale při opakovaném testování byly trvale pozitivní pouze tři kmeny. Maltóza byla oxidována, ale ne sacharóza nebo arabinóza. Na rozdíl od skupin 1 a 2 nebyla kyselina urokanová využita jako zdroj energie.

Nedávno Vogel a jeho kolegové (21) zaznamenali rozdíly mezi S. alga a S. putrefaciens v jejich citlivosti k některým antimikrobiálním látkám, včetně penicilinu, ampicilinu a tetracyklinu. To spolu se zprávou spojující hemolytickou aktivitu se S. alga a její zjevnou souvislostí s lidským onemocněním naznačuje možné rozdíly v patogenitě mezi těmito dvěma druhy (tabulka6). Proto jsme pro další analýzu vybrali 10 kmenů (5 od každého druhu). Ačkoli jsme nezaznamenali zásadní rozdíly v citlivosti k penicilinu, ampicilinu a tetracyklinu mezi těmito dvěma skupinami na základě kategorie citlivosti (citlivá, střední nebo rezistentní), všimli jsme si, že průměrné MIC pro S. alga penicilinu, ampicilinu a tetracyklinu (∼200, 56 a 5.2 μg/ml) byly vyšší než odpovídající MIC pro S. putrefaciens(3, 1,3 a 1,1 μg/ml).

Čtyři z pěti kmenů S. putrefaciens se v adherenčních testech slabě (+) až silně (+++) (tabulka 6) přichytily na buňky HEp-2; naproti tomu žádný kmen S. alga nevykazoval podobné adhezivní vlastnosti, ačkoli čtyři kmeny se silně vázaly na pozadí skleněného sklíčka. Invazivní aktivity nebyly zjištěny u žádného kmeneShewanella. Ačkoli byla pozorována opožděná hemolytická reakce na agaru z ovčí krve u všech pěti kmenů S. alga (tabulka 2), betahemolýza nebyla zjištěna technikou překrytí agaru ani bujónovými testy (tabulka 6); kontrolní kmeny E. tarda byly v obou testech pozitivní za 1 h. U všech pěti kmenů S. alga (a jednoho izolátu S. putrefaciens) byla během studií adheze a invaze někdy pozorována slabá cytotoxická reakce. Tato cytotoxická reakce se projevovala výskytem HEp-2 buněk s abnormální buněčnou morfologií, včetně buněčných zbytků (duchů). Byly však zjištěny rozdíly v patogenitě pro myši mezi těmito dvěma druhy, neboť průměrná LD50 u švýcarských myší Webster byla pro S. algawas 1,9 × 108 CFU, zatímco pro S. putrefaciens byla 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).

.