Bakteriální membránové aktivity PHMB

Pokud antibakteriální aktivita PHMB (obr. 1a) je způsobena narušením membrány, jak se všeobecně uvádí6,7,8,9,10, očekávalo by se, že bude permeabilizovat bakteriální buněčné bariéry při růstově inhibičních a subrůstově inhibičních koncentracích. K otestování tohoto modelu jsme nejprve stanovili minimální inhibiční koncentrace (MIC) a časově usmrcující vlastnosti PHMB proti Escherichia coli (kmeny K-12 a MG1655) a Salmonella enterica serovar Typhimurium (kmen LT2). Jak již bylo uvedeno dříve2,4, PHMB vykazoval silné růstové inhibiční a cidální vlastnosti (doplňková tabulka 2 a doplňkový obr. 1). Také po ošetření jsme buňky vyšetřili pomocí světelné mikroskopie. Neočekávaně inhibiční růstové koncentrace PHMB nevedly k lýze buněk, jak bylo sledováno mikroskopií v jasném poli. Pro posouzení poškození buněčné bariéry, které by mohlo být pro mikroskopii neviditelné, byly kultury E. coli K-12 kultivovány do střední log fáze, ošetřeny PHMB v přítomnosti fluorescenční sondy pro integritu membrány SYTOX®Green a poté sledovány pomocí fluorimetrie. Tato sonda je užitečná jako indikátor poškození membrány, protože je normálně vyloučena z intaktních bakterií a její fluorescenční kvantový výtěžek se zvyšuje po navázání DNA. Proto se očekává, že neporušené bakterie budou vykazovat nízkou fluorescenci a že fluorescence se zvýší po poškození buněčné bariéry16. Jak se předpokládalo, čerstvě vypěstované kultury E. coli vykazovaly velký nárůst fluorescence po ošetření známým narušitelem buněčné stěny polymyxinem B nebo po tepelném ošetření (obr. 1b). Neočekávaně vedlo ošetření PHMB k relativně nižším úrovním fluorescence. Nejpozoruhodnější je, že vyšší koncentrace PHMB vedly k fluorescenci na úrovni pozadí. Tato pozorování nejsou slučitelná s narušením membrán jako hlavním antibakteriálním mechanismem, a proto vyvolala další pochybnosti o zavedeném modelu.

Obrázek 1
obrázek1

ÚčinkyPHMB na propustnost buněčné membrány a vstup do bakterií.

(a) Struktura polyhexametylen biguanidu (PHMB; CAS# 27083-27-8); alternativní chemické názvy: polyhexanid; příklad obchodních názvů: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Další podrobnosti viz doplňková tabulka 1. PHMB se skládá z opakujících se bazických biguanidinových jednotek spojených hexamethylenovými uhlovodíkovými řetězci, které poskytují kationtovou a amfipatickou strukturu s vysokou schopností vodíkové vazby, elektrostatických a hydrofobních interakcí. Přípravky PHMB obvykle obsahují polymery smíšené délky s aminovými, guanidinovými a kyanoguanidinovými koncovými skupinami (např. průměr n = 13,8, 3,035 g/mol44). b) Účinky PHMB, tepla, polymyxinu B (pozitivní kontrola) a triclosanu (negativní kontrola) na propustnost buněk pro SYTOX®Green. Hodnoty MIC pro testované antibakteriální látky jsou označeny barevnými svislými šipkami, nahoře. (c) Fluorescenční mikroskopie vstupu PHMB-FITC do různých bakterií. PHMB-FITC (2 μg/ml) byl přidán do bakteriálních kultur a buňky byly protibarveny DAPI. (d) Konfokální snímek ukazující lokalizaci PHMB-FITC (zelená) v B. megaterium; bakterie byly protibarveny membránovou lokalizační sondou aglutininem pšeničných klíčků (WGA) konjugovaným s Alexa Fluor-555 (červená) a vizualizovány jako živé (nahoře) a fixované (dole) buňky; Bar = 5 μm. (e) Analýza grafu profilu intenzity fluorescence buněčné lokalizace fluorescence PHMB-FITC a WGA (bílá čára označuje průřez použitý pro analýzu). Zelená čára označuje hladiny FITC a polohu (především uvnitř buňky). Červená čára označuje hladiny WGA a polohu (hlavně uvnitř membrány).

PHMB vstupuje do bakterií

Pokud primárním cílem PHMB nejsou bakteriální buněčné bariéry nebo nejsou výhradně buněčné bariéry, pak pravděpodobně působí uvnitř a to by vyžadovalo vstup do buňky. Pro testování vstupu do bakterií jsme syntetizovali konjugát PHMB-FITC (doplňkový obr. 2a,b) a pomocí mikroskopie a průtokové cytometrie jsme hodnotili vychytávání do grampozitivních (Staphylococcus aureus), gramnegativních (Escherichia coli a Salmonella enterica serovar Typhimurium) a acidifikovaných (Mycobacterium smegmatis) bakterií (obr. 1c, doplňkový obr. 3). U všech testovaných druhů byla pozorována silná zelená fluorescence vázaná na buňky (obr. 1c). Pro důkladnější prozkoumání buněčné lokalizace byla velkobuněčná bakterie Bacillus megaterium ošetřena PHMB-FITC, protibarvena membránově lokalizovaným aglutininem z pšeničných klíčků (WGA-red) a vyšetřena fluorescenční mikroskopií (obr. 1d). Vstup do buněk byl pozorován u živých i fixovaných buněk a analýza profilu intenzity fluorescence ukazuje, že PHMB-FITC se lokalizoval v cytoplazmě, aniž by se hromadil na buněčné bariéře (obr. 1e).

Pozorování, že PHMB vstupuje do buněk při nízkých koncentracích mikrogramů/ml, naznačuje, že může vstupovat do živých buněk. Aby se zjistilo, zda příjem PHMB do bakterií vyžaduje energetický metabolismus, byly kultury E. coli ve střední log fázi inkubovány při 37 °C nebo při 4 °C po dobu 2 hodin, aby se snížila hladina ATP v buňkách. Následně byly buňky ošetřeny PHMB-FITC (0-6 μg/ml) a dále inkubovány 2 hodiny na ledu. Fluorescence PHMB-FITC vázaná na buňky byla kvantifikována pomocí fluorimetrie (doplňkový obr. 3b). Buňky uchovávané při 4 °C vykazovaly snížené vychytávání PHMB-FITC ve srovnání s buňkami inkubovanými při 37 °C, což odpovídá procesu vychytávání v závislosti na energii. V několika časových bodech během působení PHMB byly také pozorovány zeleně fluoreskující a pohyblivé bakterie (doplňkový obr. 3). Protože pohyblivost bakterií je závislá na energii17 , svědčí to o tom, že PHMB-FITC vstupuje do metabolicky aktivních buněk. PHMB tedy vstupuje do různých bakterií a vstup byl pozorován v pohyblivých buňkách.

PHMB zastavuje buněčné dělení a kondenzuje bakteriální chromozomy

Při mikroskopickém zkoumání E. coli jsme si všimli, že buňky ošetřené PHMB často vykazovaly protáhlou morfologii, která může být charakteristická pro inhibici buněčného dělení (obr. 2a). Abychom změřili vliv PHMB na prodlužování buněk, titrovali jsme PHMB do rostoucích kultur E. coli kmene SS996 (vide infra) a měřili délku buněk. Při koncentracích inhibujících růst se prodloužilo více než 80 % buněk (obr. 2b; doplňková tabulka 2). Také jsme pozorovali, že E. coli ošetřená inhibičními růstovými koncentracemi PHMB nebo PHMB-FITC s následným barvením DAPI vykazovala modré fluorescenční fokusy v blízkosti středu buňky (obr. 2c). Tyto struktury připomínaly nukleoidy18. Abychom usnadnili vizualizaci ohnisek DNA, vytvořili jsme vláknité/multinukleární populace E. coli inhibicí buněčného dělení pomocí RNA umlčení základního genu buněčného dělení ftsZ19. Pro tento experiment bylo zvoleno umlčování RNA, protože umožňuje specifickou a kontrolovatelnou represi translace esenciálních genových transkriptů20. Geny, které jsou nezbytné pro růst, nelze vyřadit metodami narušení genomu, protože by to vedlo k neživotaschopným kmenům. V nepřítomnosti PHMB vykazovaly vláknité buňky rovnoměrné barvení DAPI, zatímco buňky ošetřené PHMB vykazovaly modré „šňůry korálků“ (obr. 2d). Podobně u velkých grampozitivních bakterií B. megaterium jsme po ošetření PHMB pozorovali ohniska barvená DAPI (obr. 2e). Tyto výsledky u gramnegativních i grampozitivních druhů ukazují, že působení PHMB vede ke kondenzaci chromozomů v bakteriích.

Obrázek 2
obrázek2

Prodloužení buněk a kondenzace chromozomů u bakterií zprostředkované PHMB.

(a) E. coli byla ošetřena PHMB po dobu 90 minut a vyšetřena mikroskopií v jasném poli. (b) Průměrná délka buňky v závislosti na koncentraci PHMB. Je vyznačena MIC (šipka). (c) Vzor rozložení chromozomů v buňkách po ošetření PHMB-FITC. Kultury E. coli, kmen K-12, byly ošetřeny PHMB-FITC, protibarveny DAPI a vyšetřeny pomocí fluorescenční mikroskopie. Chromozomy se jeví jako kondenzovaná ohniska barvená DAPI; více patrné na zvětšeném snímku. (d) Vzor rozložení chromozomů ve vláknitých/multinukleárních E. coli po expozici PHMB. RNA umlčení exprese ftsZ bylo použito k zastavení buněčného dělení a buňky byly poté neošetřeny nebo ošetřeny PHMB, obarveny DAPI a vyšetřeny fluorescenčním mikroskopem. (e) Vzor rozložení chromozomů v buňkách B. megaterium, které byly neošetřeny nebo ošetřeny PHMB, obarveny DAPI a WGA-red a vyšetřeny pomocí fluorescenční mikroskopie.

Antibakteriální účinky zprostředkované PHMB jsou nezávislé na drahách stresové odpovědi

Prodloužení buněk a kondenzace chromozomů jsou charakteristické morfologické jevy, které jsou často spojovány s bakteriální SOS odpovědí21,22 . Proto jsme se domnívali, že by tyto účinky mohly zahrnovat tuto odpověď. V případě účinků zprostředkovaných PHMB se však SOS odpověď zdála nepravděpodobná. Za prvé, SOS odpověď je obvykle spojena s poškozením DNA a neexistují žádné důkazy o genotoxických nebo epigenetických účincích zprostředkovaných PHMB23. Za druhé, ke kondenzaci pozorované po umlčení ftsZ a ošetření PHMB došlo u kmene recA- (TOP10), který je mutantem SOS odpovědi. Nicméně antimikrobiální mechanismy je notoricky obtížné rozluštit a mohou zahrnovat více mechanismů. Proto jsme se rozhodli posoudit možné zapojení SOS odpovědi a dalších drah stresové odpovědi pomocí reportérového kmene SOS a panelu mutantů dráhy stresové odpovědi E. coli.

Pro testování, zda jsou účinky PHMB na prodlužování buněk a kondenzaci chromozomů změněny mutacemi dráhy SOS odpovědi, jsme hodnotili morfologické odpovědi u tří mutantních kmenů E. coli. Kmen SS996 je schopen iniciovat SOS odpověď, ale v důsledku mutace sulB odpověď nevede k inhibici buněčného dělení. Je to proto, že SS996 má mutantní alelu ftsZ (sulB103), jejíž produkt je necitlivý k působení inhibitoru buněčného dělení SulA24 vyvolaného SOS. Kmen JW2669 neprodukuje funkční RecA, a je tedy SOS deficientní. Kmen AB2474 má mutaci v represoru LexA, která způsobuje, že není odbouratelný RecA, a není tedy schopen vyvolat SOS odpověď (další podrobnosti o kmeni jsou uvedeny na obr. 3 a v tabulce 3 doplňkových informací). Kultury ve střední log fázi byly ošetřeny PHMB, obarveny DAPI a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem. Jak bylo pozorováno u E. coli K-12, mutantní kmeny vykazovaly po ošetření PHMB prodlouženou morfologii a kondenzované chromozomy (obr. 3a). K účinkům buněčného dělení a struktury chromozomů zprostředkovaným PHMB tedy dochází nezávisle na programované odpovědi SOS.

Obrázek 3
obrázek3

Účinky PHMB na bakteriální odpovědi SOS.

(a) Kondenzace chromozomů u kmenů E. coli SS996 (sulB103; mutant FtsZ necitlivý na SulA), JW2669 (recA-; knock-out recA) a AB2474 (lexA1, mutace, která zabraňuje indukci SOS odpovědi) po ošetření PHMB po dobu 2 hodin. Buňky byly obarveny DAPI k odhalení DNA. (b) Exprese reportéru SOS odpovědi, kvantifikovaná pomocí fluorimetrie. Reporter SOS kmen E. coli SS996 nesoucí chromozomální fúzi sulAp-gfp nebyl ošetřen nebo byl ošetřen PHMB, mitomycinem C, známým induktorem SOS, nebo triclosanem, který nevyvolává SOS odpověď. Hodnoty MIC proti SS996 byly PHMB, 0,75 μg/ml; triclosan, 2 μg/ml; mitomycin C, 0,06 μg/ml a tyto hodnoty byly použity pro výpočet %MIC.

Pro přímější měření, zda PHMB indukuje SOS odpověď, jsme použili kmen E. coli SS996, což je reportérový kmen, který obsahuje sulAp-gfp chromozomální SOS odpověď/reportérový systém24,25 . Pokud je SOS odpověď vyvolána PHMB, pak by expozice PHMB měla u tohoto kmene vyvolat expresi GFP. Kultury SS996 byly ošetřeny PHMB po dobu 18 hodin a poté byla měřena zelená fluorescence. Jako pozitivní kontrola byl zařazen mitomycin C, který poškozuje DNA, a jako negativní kontrola triklosan, který inhibuje biosyntézu mastných kyselin. Podle očekávání mitomycin C vyvolal velké zvýšení exprese GFP a triklosan expresi GFP nevyvolal. Na rozdíl od mitomycinu C PHMB neindukoval expresi GFP, což naznačuje, že PHMB nevyvolává SOS odpověď (obr. 3b).

Dále jsme testovali, zda se kmeny s defektní nebo deregulovanou SOS odpovědí liší v citlivosti k PHMB. K testování vlivu recA na citlivost jsme použili kmen E. coli, který postrádá recA (JW2669), a kmen, který nadměrně exprimuje recA po přidání induktoru IPTG (ASKA JW2669), a stanovili jsme hodnoty MIC. Ani delece, ani indukovaná nadměrná exprese recA nezměnily citlivost k PHMB (doplňkové informace, tabulka 3, řádky vystínované tmavě šedě). Naopak recA- kmen byl 2krát citlivější k léčivu vyvolávajícímu SOS reakci kyselině nalidixové a nadměrná exprese recA snížila citlivost ke kyselině nalidixové 8krát. K testování vlivu lexA na citlivost k PHMB jsme použili kmen lexA1(Ind-) AB2474, který není schopen vyvolat SOS odpověď. Ve srovnání s rodičovským kmenem byl AB2474 1krát citlivější k PHMB a 1krát méně citlivý ke kyselině nalidixové (doplňková tabulka 3, řádky vystínované světle šedě). Žádný z testovaných mutantů SOS odpovědi tedy nevykazoval změny v citlivosti k PHMB, které by naznačovaly zapojení SOS odpovědi.

Nakonec jsme zvažovali, zda citlivost k PHMB ovlivňují jiné (ne-SOS) dráhy stresové odpovědi. Testovali jsme řadu známých mutantů E. coli reagujících na stres paralelně s jejich rodiči na citlivost k PHMB. Žádný z mutantů nevykazoval změny hodnot MIC, které by naznačovaly funkční zapojení některé z drah stresové odpovědi (doplňková tabulka 3). Antibakteriální účinky PHMB se tedy projevují nezávisle na panelu testovaných mechanismů stresové odpovědi.

PHMB kondenzuje bakteriální chromozomy in vitro

Pokud PHMB kondenzuje bakteriální chromozomy uvnitř buněk, může k tomu docházet prostřednictvím přímých nebo nepřímých účinků na DNA. Předpokládali jsme přímé účinky, protože bylo prokázáno, že PHMB se in vitro váže na fragmenty DNA15. Rozhodli jsme se prozkoumat vazebné vlastnosti PHMB na DNA pomocí izolované chromozomální DNA E. coli. Interakce PHMB s DNA byly nejprve zkoumány pomocí testu elektroforetického pohybového posunu (EMSA) a testu vylučování barviva. PHMB byl smíchán s chromozomální DNA izolovanou z E. coli K-12 a směsi byly frakcionovány v agarosových/TBE gelech s následným barvením DNA ethidium bromidem. Směsi PHMB:DNA s hmotnostními poměry ≥0.5 vykazovaly zřetelně zpomalenou elektroforetickou pohyblivost, jak ukazuje zadržení DNA v jamce (obr. 4a). Podobné výsledky byly získány pro PHMB-FITC. Zpomalená pohyblivost a zadržování v jamkách odpovídá stabilním interakcím mezi PHMB a DNA. Také testy EMSA ukázaly sníženou fluorescenci ethidium bromidu v přítomnosti PHMB nebo PHMB-FITC, což naznačuje, že ethidium bromidu bylo zabráněno ve vazbě na DNA v důsledku tvorby komplexů PHMB:DNA. Toto pozorování bylo dále zkoumáno pomocí barviva SYTOX®Green vázajícího DNA v testu vylučování barviva. V nepřítomnosti PHMB vázal SYTOX®Green izolovanou DNA E. coli, což se projevilo velkým nárůstem fluorescence v porovnání s přídavkem samotného barviva. Předchozí přídavek PHMB však snížil fluorescenci >80 % (obr. 4b). PHMB tedy tvoří komplexy s bakteriální DNA způsobem, který zpomaluje elektroforetickou pohyblivost a maskuje přístup DNA k ligandům DNA. Výsledky každého z těchto experimentů naznačují, že PHMB se váže přímo na DNA.

Obrázek 4
obrázek4

Vazba PHMB na bakteriální chromozomální DNA in vitro.

(a) PHMB nebo PHMB-FITC byly smíchány s izolovanou chromozomální DNA z kmene E. coli K-12 a vzorky byly analyzovány pomocí EMSA. Vzorky zpomalené pohyblivosti v gelu ukazují na vazbu DNA pomocí PHMB. (b) PHMB zprostředkované vyloučení vazby SYTOX®Green na izolovanou chromozomální DNA E. coli, kde snížená fluorescence ukazuje na vazbu DNA pomocí PHMB. (c) Spektroskopie kruhového dichroismu směsí PHMB a izolované chromozomální DNA E. coli. (d) Graf elipticity jako funkce poměru PHMB:DNA.

Abychom se dozvěděli více o tom, jak vazba PHMB na DNA ovlivňuje strukturu chomosomální DNA, použili jsme biofyzikální metody a mikroskopii. Kombinace PHMB a izolované chromozomální DNA E. coli byly zkoumány pomocí spektroskopie kruhového dichroismu (CD). Samotná PHMB nevykazovala charakteristické CD spektrum, zatímco izolovaná chromozomální DNA vykazovala typické DNA spektrum s pozitivním maximem elipticity kolem 260 nm, negativním křížem při 252 nm a negativním žlabem kolem 245 nm. To nám umožnilo posoudit změny v CD spektru DNA po přidání PHMB. Směsi PHMB a DNA vykazovaly sníženou elipticitu při 260 nm, což svědčí o strukturních změnách DNA po navázání PHMB (obr. 4c,d). Také dynamický rozptyl světla (DLS) ukázal, že vazba PHMB na DNA vede ke vzniku nanočástic o velikosti přibližně 50-60 nm s nízkým indexem polydisperzity (doplňkový obr. 4a). Konečně transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a fluorescenční mikroskopie rovněž ukázaly, že vazba PHMB na DNA vede k tvorbě nanočástic (doplňkové obr. 4b,c). Tyto výsledky tedy potvrzují dřívější zprávy o tom, že PHMB váže DNA26 , a odhalují, že PHMB váže izolovanou bakteriální chromozomální DNA a může kondenzovat chromozomy do populace nanočástic s nízkou polydisperzitou.

Antibakteriální účinky PHMB jsou potlačeny ligandem dsDNA

Naše výsledky účinků PHMB na bakterie nelze sladit s modelem narušení membrán pro primární antibakteriální mechanismus účinku PHMB. Navrhujeme spíše nový model, kdy PHMB vstupuje do bakterií a poté kondenzuje chromozomy, jak je znázorněno na obr. 5a. Pokud by byl nový model správný, předpovídal by také funkční interakce mezi PHMB a dalšími ligandy DNA a tato myšlenka nám poskytla způsob, jak model otestovat. Stručně řečeno, pokud by byl tento model správný, očekávalo by se, že ligandy DNA s malou molekulovou hmotností potlačí antibakteriální účinnost PHMB tím, že budou soutěžit o vazebná místa DNA v chromozomech. K ověření této možnosti byly použity párové kombinace PHMB a Hoechst 33258 v testech citlivosti k růstu. Hoechst 33258 je ligand DNA, který se přednostně váže na minoritní drážku sekvencí bohatých na AT27 a je propustný pro buňky, což z něj činí vhodnou volbu pro tento konkurenční experiment.

Obrázek 5
obrázek 5

Model antibakteriálního mechanismu účinku PHMB a potlačení inhibice růstu.

(a) Navrhovaný antibakteriální mechanismus účinku PHMB. (b) Párové interakce inhibice růstu mezi PHMB a Hoechstem 33258 a negativními kontrolními ligandy nevázanými na DNA (triklosan a trimethoprim) u různých druhů bakterií. (c) Vztah mezi obsahem AT v bakteriálním genomu a antibakteriálními interakcemi s PHMB. Graf interakcí inhibice růstu a AT-obsahu DNA u různých druhů. Hodnoty interakcí jsou ukazatele frakční inhibiční koncentrace (FICI) mezi PHMB a Hoechstem 33258 nebo negativními kontrolními ligandy nevázanými na DNA (trimetoprim a triklosan). (d) Inhibice růstu Bacillus megaterium pomocí PHMB a potlačení kombinací s DNA ligandem Hoechst 33258 (modré čáry). Seznam druhů a hodnoty inhibice viz doplňková tabulka 4.

Lékové interakce byly vypočteny jako hodnoty indexu frakční inhibiční koncentrace (FICI) s použitím panelu odlišných bakteriálních druhů. Hodnoty FICI pro PHMB:Hoechst byly výrazně vyšší než pro PHMB v kombinaci s kterýmkoli ze dvou antibakteriálních látek bez ligandu DNA (obr. 5b). Také hodnoty FICI pro kombinace PHMB:Hoechst vykazují pozitivní korelaci s obsahem AT chromozomů (obr. 5c). Jinými slovy, antimikrobiální účinky PHMB závisí na přístupu k DNA uvnitř buněk. U B. megaterium byly účinky kombinací PHMB:Hoechst nápadné, kdy inhibice růstu pomocí PHMB byla potlačena použitím subinhibičních koncentrací Hoeschst 33258 (obr. 5d). Malá molekula DNA ligandu Hoechst 33258 tedy zachránila bakterie před inhibičními koncentracemi PHMB.

Tyto párové interakce léčiv ukazují, že antibakteriální účinky PHMB probíhají především prostřednictvím cílení na DNA v bakteriích. V souladu s profilem změny propustnosti buněk pozorovaným u PHMB (obr. 1b); výsledky také naznačují konkurenci mezi PHMB a ligandem DNA o vazebná místa pro DNA uvnitř buněk. Výsledky samostatných experimentů se dvěma známými ligandy DNA jsou tedy v souladu s naším novým modelem aktivity PHMB.

PHMB vstupuje do savčích buněk, ale je vyloučen z jader

Převládající model aktivity PHMB tvrdí, že PHMB zabíjí bakterie prostřednictvím poškození bakteriální membrány a polymer neinteraguje s membránami savčích buněk (viz výše). Avšak vzhledem k neočekávaným vlastnostem PHMB při vstupu do bakteriálních buněk a našim nedávným pozorováním, že PHMB vstupuje do kultivovaných makrofágů28 a keratinocytů29 , jsme se rozhodli přímo posoudit jeho schopnost vstupovat do panelu savčích buněk. PHMB-FITC byl přidán k několika savčím buněčným liniím a primárním fibroblastům a vychytávání bylo hodnoceno pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pozorovali jsme jasné vychytávání ve všech testovaných typech buněk (obr. 6a,b). Tyto podmínky také nevedly k narušení integrity membrány savčích buněk (doplňkový obr. 5a). Podrobná kontrola mikroskopických snímků ukazuje, že PHMB-FITC byl obsažen ve vezikulách a vyloučen z jader (obr. 6a). Pokud je pravda, že endozomy zachycují PHMB, pak by uvolnění do cytoplazmy mělo vést k deaktivaci PHMB-FITC a ke zvýšení fluorescence. Je tomu tak proto, že fluorescence FITC je zhášena při nízkém pH a pozdní endozomální pH je <630, zatímco cytoplazmatické pH je 7,4. Pozorovali jsme, že přídavek chlorochinu, osmolytického/pufrujícího činidla31 , zvýšil fluorescenci buněk ošetřených PHMB-FITC (obr. 6c), což odpovídá zachycení polymeru v endosomech. PHMB tedy účinně vstupuje do savčích buněk, ale je zachycen v endosomech, což zřejmě omezuje vstup do jader.

Obrázek 6
obrázek6

Vstup PHMB do savčích buněk.

(a) Primární fibroblasty byly ošetřeny PHMB-FITC (3,5 μg/ml), protibarveny Hoechstem 33258 a pozorovány fluorescenční mikroskopií. (b) Průtoková cytometrická analýza panelu savčích buněk ošetřených PHMB-FITC. Vložka: reprezentativní příklad histogramu průtokové cytometrie populací HeLa buněk, které nebyly ošetřeny (fialová populace) nebo byly ošetřeny PHMB-FITC (0,4 μg/ml) (zelená populace). (c) HeLa buňky byly ošetřeny PHMB-FITC (3,5 μg/ml) a chlorochinem (0-20 μM) po dobu 2 hodin. Účinek chlorochinu na fluorescenci byl měřen průtokovou cytometrií s použitím geometrické střední intenzity fluorescence (arbitrární jednotky (A.U.), logaritmická stupnice).

.

Articles

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.