Bookshelf

Corrective factors and recognition signals

Et modelsystem for enzymerstatningsterapi opstod i forbindelse med undersøgelser af dyrkede hudfibroblaster fra patienter med mucopolysaccharidlagringssygdomme (MPS). Sådanne fibroblaster viste overdreven ophobning af glykosaminoglykaner, hvilket blev fortolket som værende forårsaget af utilstrækkelig nedbrydning af disse makromolekyler . Man opdagede tilfældigt, at en blanding af fibroblaster fra patienter med MPS I (Hurler-syndromet) og MPS II (Hunter-syndromet) havde et normalt mønster for glykosaminoglykanmetabolisme (figur 1) . De to sygdomme var kendt for at være genetisk forskellige, idet MPS I nedarves autosomalt recessivt og MPS II er en X-bunden sygdom, hvilket fik Fratantoni et al. til at opstille den hypotese, at fibroblaster af forskellige genotyper forsynede hinanden med det manglende genprodukt. Yderligere undersøgelser viste, at det ikke var nødvendigt at have de genetisk forskellige celler i kontakt med hinanden for at opnå en sådan krydskorrektion, da et medium, der er konditioneret af den ene, kan være korrigerende for den anden. Strategien med krydskorrektion kunne udvides til at omfatte beslægtede sygdomme – celler, der korrigerede hinanden, ville have en anden genotype, mens celler, der ikke krydsede hinanden, ville have den samme genotype (men se den vigtige undtagelse nedenfor).

Da Hurlers syndrom var blevet postuleret som en lysosomal lagringssygdom baseret på observation af de dramatisk hævede leverlysosomer hos de berørte patienter , stillede Fratantoni et al. den hypotese, at de “korrigerende faktorer” i konditioneret medium kunne være lysosomale enzymer, der blev udskilt af den ene cellelinje og endocytoseret af den anden. De korrigerende faktorer svarede imidlertid ikke til noget lysosomalt enzym, der var kendt på det tidspunkt (denne situation ændrede sig et par år senere, da en β-glucuronidase-mangel-MPS blev opdaget ). Oprensning af Hurler- og Hunter-korrektionsfaktorerne blev foretaget, ikke fra konditioneret medium, men fra urin, en kropsvæske, der er relativt rig på lysosomale enzymer. Funktionen blev tildelt de oprensede faktorer ved hjælp af en række biokemiske metoder, hvilket resulterede i, at Hurler- og Hunter-korrektionsfaktorerne blev benævnt henholdsvis α-l-iduronidase og iduronatsulfatase .

Celler, der havde brug for Hurler-korrektionsfaktor for at normalisere deres glykosaminoglykanmetabolisme (fra patienter med Hurler-syndrom og med Scheie-syndrom ) var også mangelfulde i α-l-iduronidaseaktivitet ). Korrektion af Hurler-fibroblaster blev ledsaget af optag af α-l-iduronidase. Som et godt varsel for enzymerstatningsterapi var optagelsen bemærkelsesværdigt effektiv, og kun en meget lille mængde α-l-iduronidase skulle internaliseres for at give fuldstændig korrektion.

Dette kunne have været slutningen af historien, bortset fra en lille uoverensstemmelse i elueringsmønsteret for den enzymatiske aktivitet og den korrigerende aktivitet fra en hydroxyapatitsøjle , hvilket tyder på, at de to aktiviteter af Hurler-korrektionsfaktoren ikke var nøjagtigt identiske. Som opfølgning på denne uoverensstemmelse adskilte Shapiro et al. α-l-iduronidase i korrigerende og ikke-korrigerende fraktioner på en heparin-Sepharose-søjle, hvilket tyder på, at den korrigerende faktor havde en eller anden egenskab, der ikke var nødvendig for den katalytiske aktivitet, men som var nødvendig for optagelsen. På samme måde blev der fundet flere former for β-glucuronidase, der adskiller sig i optag og korrigerende aktivitet .

Eksistensen af et specifikt signal for optag af et lysosomalt enzym var blevet antydet af resultaterne af en undersøgelse af en nyopdaget lidelse, der ligner MPS – kaldet inklusionscellesygdom (I-cell disease) på grund af de fremtrædende fase-tætte inklusioner i dyrkede fibroblaster . Mens disse fibroblaster havde flere lysosomale enzymmangler, indeholdt mediet omkring dem et stort overskud af lysosomale enzymer . De enzymer, der blev udskilt af fibroblaster med I-celle sygdom, blev imidlertid ikke endocytoseret af andre celler og var ikke korrigerende; formodentlig manglede de signalet til optagelse i lysosomer . Da en række lysosomale enzymer blev påvirket af denne enkeltgenfejl (I-cell disease nedarves autosomalt recessivt), blev det postuleret, at signalet var en posttranslationel modifikation af enzymproteinerne. Det blev endvidere postuleret, at det var af kulhydratmæssig art, da det kunne ødelægges ved en mild periodatbehandling . Konceptet om et genkendelsessystem baseret på kulhydrater blev stærkt påvirket af Ashwell og kollegers opdagelser vedrørende kulhydraternes rolle i leverens optagelse af cirkulerende glykoproteiner .

Forsekomsten af et specifikt genkendeligt signal indebar en mættelig, receptormedieret proces og antydede, at optagelsen af lysosomale enzymer ville følge Michaelis-Menten-kinetikken. Det blev forventet, at analoger af genkendelsessignalerne ville opføre sig som kompetitive hæmmere af optagelsen. Denne forventning blev undersøgt via optagelsen af α-l-iduronidase og β-glucuronidase af de tilsvarende defekte fibroblaster. Kaplan et al.s opdagelse af, at den bedste inhibitor af β-glucuronidaseoptagelse var mannose-6-fosfat (M6P), og deres forslag om, at M6P var (eller var en del af) det længe eftersøgte genkendelsessignal, var overraskende, da der ikke tidligere var blevet rapporteret om fosforyleret kulhydrat på glykoproteiner fra pattedyr . Det blev straks bekræftet for optagelsen af α-l-iduronidase og andre lysosomale enzymer ved hjælp af en række biokemiske metoder ; det endelige bevis kom fra strukturanalyse af de fosforylerede kulhydratgrupper . Det signal, der blev opdaget gennem endocytose, viste sig også at være signalet for målretning af spirende hydrolaser til lysosomer .

Den defekt i I-celle sygdom, som forhindrer cellerne i at syntetisere M6P genkendelsessignalet, blev vist at være en mangel på det første af to enzymer, der er involveret i syntesen af M6P-signalet . To receptorer for M6P blev opdaget; kemi og biologi for M6P-receptorerne og deres rolle i celletrafikken blev et bredt og meget aktivt område inden for cellebiologien . Disse emner er genstand for mange oversigter, herunder kapitel 3 og 5 i dette bind. Betydningen af M6P-systemet for enzymerstatningsterapi vil blive diskuteret nedenfor.

Samtidig med disse undersøgelser i dyrkede fibroblaster førte et in-vivo-system til fundet af et andet signal for optagelse af lysosomale enzymer. Adskillige lysosomale enzymer, der blev injiceret intravenøst i rotter, viste sig at blive hurtigt clearet fra cirkulationen; de blev dog persisteret meget længere, hvis de blev forbehandlet med periodat eller hvis de blev co-injiceret med et agalactoglycoprotein . Igen blev det postuleret, at kulhydrater kunne give signaler til specifik genkendelse. I dette tilfælde var mannose det vigtigste sukkerstof til genkendelse, og optagelsen foregik i reticuloendothelceller i leveren . Mannose-receptoren, som genkender N-acetylglucosamin og l-fucose samt mannose, blev påvist at forekomme på overfladen af makrofager . Det er af en vis historisk interesse, at invertaseoptagelsesforsøgene, som indtog en fremtrædende plads i det oprindelige forslag om enzymerstatningsterapi (se ovenfor ), lykkedes, fordi invertase er et glykoprotein med mannankæder, der genkendes af mannosereceptoren .