Biokemiske og patogene egenskaber af Shewanella alga og Shewanella putrefaciens

RESULTATER

Biotypning af Shewanella-isolater efter to separate skemaer gav lignende resultater (tabel 1). De fleste kliniske isolater (74 %) tilhørte Gilardi biovar 2 (CDC biotype 2), idet de var saccharose- og maltose-negative ved vækst på SS agar og på medier med høje NaCl-koncentrationer. Den eneste væsentlige forskel mellem Gilardi-klassifikationsskemaet (6) og Weyant et al. (22) var, at biovar 3-isolater (saccharose-, maltose-, SS- og NaCl-negative) ikke blev grupperet af CDC’s biotyping-system. I modsætning til de humane isolater var biovar 1 (CDC-biotype 1) fremherskende (67 %) blandt de ikke-humane stammer. Disse stammer producerede typisk syre fra maltose og/eller saccharose og kunne ikke vokse på agar med højt saltindhold eller SS-agar. På grundlag af de nylige taksonomiske forslag fra Nozue og andre (15) ville biovar 2-stammer (CDC biotype 2) blive identificeret som S. alga, mens alle biovar 1-stammer (CDC biotype 1) og 6 ud af 7 biovar 3-stammer ville blive betegnet som S. putrefaciens; den resterende biovar 3-stamme blev efterfølgende identificeret som S. alga. Klinisk set blev S. alga fundet dominerende (77 %), mens størstedelen af de ikke-humane isolater (89 %) blev bekræftet som S. putrefaciens (tabel 1).

Alle 10 Shewanella-isolater blev ved testning på API 20E-, API NFT-, RapID NF Plus- og Vitek-systemerne identificeret somS. putrefaciens med én undtagelse. Fire ud af femS. putrefaciens-isolater gav uacceptable profilnumre på API 20E-systemet (nr. 0602026 og 0602006); den femte stamme gav et sjældent biotypenummer for S. putrefaciens. Alle S. alga-stammer gav en fremragende identifikation som S. putrefaciens på API 20E-systemet. API NFT-systemet identificerede alle 10 Shewanella-isolater som S. putrefaciens med gode til fremragende identifikationer, med én undtagelse, også en S. putrefaciens-stamme (lav diskriminationsværdi, 48 timer). RapID NF Plus identificerede alle 10 Shewanella-isolater som S. putrefaciens med en nøjagtighed på 99,9 %. På samme måde blev alle stammer identificeret af Vitek (97-99 % nøjagtighed) som S. putrefaciens, selv om tre S. putrefaciens-stammer krævede 5-9 timers inkubation før endelig identifikation, i modsætning til resultaterne på 4 timer for de andre 7 stammer. Kulhydratreaktioner (arabinose og maltose) på API 20E-, API NFT- og Vitek-systemerne gør det imidlertid muligt at henføre de fleste stammer korrekt til de relevante taxa (S. putrefaciens ogS. alga), hvis de aflæses manuelt efter endelige identifikationer som S. putrefaciens.

Sammenligning af de biokemiske og enzymatiske egenskaber hosShewanella-arter afslørede en række forskelle (tabel 2). Hæmolyse på fåreblodagar, som rapporteret af Nozue et al. (15), blev påvist i alleS. alga-stammer, men kun i et par af S. putrefaciens-isolaterne. De fleste S. alga-stammer udviste kun denne fænotype efter langvarig inkubation (48 til 72 timer), og området med hæmolyse var ofte uregelmæssigt og vanskeligt at påvise. Andre aktiviteter, der tidligere er fundet at kunne hjælpe med at adskille S. alga og S. putrefaciens, såsom vækst ved 42 °C, vækst på medier med høje saltkoncentrationer (6,5 %) og syreproduktion fra arabinose, saccharose og maltose, blev bekræftet. Vi fandt et væsentligt større antal S. putrefaciens-stammer, der voksede på SS-agar end tidligere rapporteret; de fleste af disse stammer fra ikke-humane kilder. Med undtagelse af ribose var produktion af syre fra kulhydratoxidation udelukkende forbundet med S. putrefaciens. Sukkermønstre varierede imidlertid betydeligt blandt disse isolater, idet nogle var arabinose-, maltose- og saccharosepositive, mens andre kun var positive for maltose eller var asaccharolytiske (biovar 3-stammer). Der blev påvist flere nye enzymatiske aktiviteter blandt udvalgte Shewanella-isolater, som så vidt vi ved ikke tidligere er blevet rapporteret. Disse omfattede tyrosinase-, alkylsulfatase-, chitinase- og elastaseaktiviteter (tabel 2); de fleste af disse enzymer blev fundet i ikke-humane isolater afS. putrefaciens. De fleste S. alga- ogS. putrefaciens-stammer producerede en siderofor, som bestemt ved Chrome Azurol S-assays. Denne aktivitet var svag, og fem isolater (tre S. alga- og to S. putrefaciens-isolater) kunne ikke vokse på dette medium.

Udvalgte Shewanella-isolater, der voksede godt ved 35 °C, blev yderligere karakteriseret for enzymatisk aktivitet ved hjælp af API-ZYM (tabel 3) og for cellulære fedtsyreprofiler med MIDI-systemet. Af de ni substrater, der blev angrebet af en eller begge Shewanella-arter med API-ZYM, var højere samlede aktiviteter for syv af disse enzymer forbundet med S. alga. Den eneste aktivitet, der viste sig at være stærkere i S. putrefaciens, var valin arylamidase, selv om denne aktivitet var ekstremt svag selv i disse stammer. Begge arter producerede en ensartet stærk alkalisk fosfataseaktivitet. En yderligere observation var, at alle S. alga-stammer konsekvent producerede otte af disse ni enzymer, den eneste undtagelse var valin arylamidase. I modsætning hertil var S. putrefaciens mere heterogen, idet fire af de ni påviste enzymer ikke var universelt til stede i alle isolater. Analyse af 14 Shewanella-stammer viste, at de fremherskende fedtsyrer var i-15:0, 17:1ω8c og 16:0; nogle stammer producerede store mængder 16:1ω7c (9 til 18 %), mens andre producerede ubetydelige mængder. Mens de fleste fedtsyretoppe var ret ensartede blandt de testede S. alga- og S. putrefaciens-stammer, blev der konstateret adskillige forskelle (Tabel4). Der blev noteret højere gennemsnitsværdier af pentadecansyre og cis-9-heptadecensyre (17:1ω8c) for S. alga, mens det omvendte var tilfældet for S. putrefaciens med hensyn til hexadecansyre og dodecansyre. For hexadecansyre blev der ikke observeret nogen overlapning i det samlede fedtsyreområde mellemS. alga og S. putrefaciens; for pentadecansyre og 17:1ω8c producerede kun ét S. putrefaciens- eller S. alga-isolat en værdi, der faldt inden for det andet isolats område. Mens ingen enkelt top var diagnostisk, adskilte brugen af alle fire toppe sammen klart de 14Shewanella-stammer i to grupper langs artslinjer.

Det blev konstateret, at de 23 stammer af S. putrefacienskunne opdeles i tre separate grupper baseret på flere fænotypiske karakteristika (tabel 5). Gruppe 1, som bestod af otte stammer, herunder ATCC 8073, producerede syre fra maltose, saccharose og arabinose og udnyttede urokansyre. Gruppe 1-stammer var ligeligt fordelt mellem kliniske og ikke-humane isolater. Gruppe 2-stammer (n = 6), som omfattede ATCC 8071, adskilte sig hovedsageligt fra gruppe 1-stammer ved manglende evne til at oxidere saccharose og maltose. Igen stammede halvdelen af disse stammer fra klinisk materiale. Gruppe 3-stammer (n = 9), som alle var af miljømæssig oprindelse (Lake Michigan-området), adskilte sig dramatisk fra gruppe 1 og 2. De voksede dårligt eller undlod at vokse ved 35 °C, producerede chitinase og var ikke-pigmenterede på trytofanagar. Alle ni stammer i gruppe 3 producerede oprindeligt α-glucosidase, men efter fornyet testning var kun tre stammer konsekvent positive. Maltose blev oxideret, men ikke saccharose eller arabinose. I modsætning til gruppe 1 og 2 blev urokansyre ikke udnyttet som energikilde.

For nylig har Vogel og kolleger (21) bemærket forskelle mellem S. alga og S. putrefaciens i deres modtagelighed over for visse antimikrobielle stoffer, herunder penicillin, ampicillin og tetracyclin. Dette, sammenholdt med rapporten, der forbinder hæmolytisk aktivitet med S. alga og dens tilsyneladende sammenhæng med sygdom hos mennesker, tyder på mulige forskelle i patogenicitet mellem disse to arter (tabel 6). Vi udvalgte derfor 10 stammer (5 fra hver art) til yderligere analyse. Selv om vi ikke bemærkede større forskelle i modtagelighed for penicillin, ampicillin og tetracyclin mellem disse to grupper baseret på modtagelighedskategorien (modtagelig, intermediær eller resistent), bemærkede vi dog, at de gennemsnitlige MIC’er for S. alga af penicillin, ampicillin og tetracyclin (∼200, 56 og 5.2 μg/ml, henholdsvis) var større end de tilsvarende MIC’er for S. putrefaciens(henholdsvis 3, 1,3 og 1,1 μg/ml).

Fire af fem S. putrefaciens-stammer hæftede svagt (+) til stærkt (+++) (tabel 6) (tabel 6) til HEp-2-celler i adhæsionsassays; i modsætning hertil udviste ingen S. alga-stammer lignende adhæsionsegenskaber, selv om fire stammer bandt stærkt til baggrunden på glasplade. Der blev ikke påvist invasive aktiviteter hos nogen Shewanella-stamme. Selv om der blev observeret en forsinket hæmolytisk reaktion på fåreblodagar for alle fem S. alga-stammer (tabel 2), blev der ikke påvist betahæmolyse med agaroverlejringsteknikken eller bouillonassays (tabel 6); kontrol E. tarda-stammer var positive efter 1 time i begge tests. For alle fem S. alga-stammer (og et S. putrefaciens-isolat) blev der undertiden observeret en svag cytotoksisk reaktion under adhæsions- og invasionsundersøgelser. Denne cytotoksiske reaktion viste sig ved, at der opstod HEp-2-celler med unormal cellemorfologi, herunder celleaffald (ghosts). Der blev imidlertid fundet forskelle i patogenicitet hos mus mellem disse to arter, idet den gennemsnitlige LD50 i schweiziske Webster-mus for S. alga var 1,9 × 108 CFU, mens den for S. putrefaciens var 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).