Abstract
Poly(lactic-co-glycolic acid) eller PLGA er en bionedbrydelig polymer, der anvendes i en bred vifte af medicinske anvendelser. Specifikt PLGA-materialer er også udviklet til dentalområdet i form af stilladser, film, membraner, mikropartikler eller nanopartikler. PLGA-membraner er blevet undersøgt med lovende resultater, enten alene eller kombineret med andre materialer i knoglehelingsprocedurer. PLGA-stilladser er blevet anvendt til regenerering af beskadiget væv sammen med stamcellebaseret terapi. Der er solide beviser for, at udviklingen af PLGA-mikropartikler og -nanopartikler kan være til gavn for en lang række dentale områder såsom endodontisk behandling, tandkaries, tandkirurgi, tandimplantater og parodontologi. Formålet med denne artikel var at gennemgå de seneste fremskridt inden for PLGA-materialer og deres potentielle anvendelsesmuligheder inden for tandpleje.
1. Indledning
Poly(lactic-co-glycolic acid) eller PLGA er et af de mest succesfuldt anvendte syntetiske bionedbrydelige polymerer på det medicinske område, der er godkendt af den amerikanske Food and Drugs Administration og Det Europæiske Lægemiddelagentur . Biokompatibilitet, bionedbrydelighed, fleksibilitet og minimale bivirkninger er de vigtigste fordele ved anvendelse af denne polymer til biomedicinske anvendelser. De vigtigste syntese- og nedbrydningsmekanismer er beskrevet i figur 1. I dette arbejde beskrives detaljeret de nuværende anvendelser af PLGA inden for tandlægevidenskab og forholdet mellem forskellige tandlægevidenskabelige områder såsom endodonti, parodontologi, tandkaries, tandkirurgi og tandimplantater og forskellige PLGA-materialer: membraner, stilladser, film og nano- eller mikropartikler.
2. PLGA i tandplejen
PLGA-materialer viser sig at være effektive i en lang række tandlægeapplikationer, som det fremgår af figur 2. De anvendes på en lang række måder, lige fra udvikling af skruer til knoglefiksering , behandling af parodontale patogener , og fremstilling af buccal mucosa eller i direkte pulpafyldningsprocedurer . PLGA kan anvendes i parodontalbehandling til bedre lokal administration af antibiotika og til at mindske de systemiske bivirkninger ved generel antibiotikatilførsel i form af PLGA-implantater , skiver og dentalfilm . Gelkompositstoffer af PLGA kan også anvendes til knogleregenerering , da stærkt nedbrydelige PLGA- og SiO(2)-CaO-gel-fiberdugstoffer, der blev udsat for simuleret kropsvæske i 1 uge, førte til aflejring af et lag apatitkrystaller på deres overflade . Granulær komposit af gatifloxacin-belastet PLGA og b-tricalciumphosphat er et lokalt leveringsmiddel til behandling af osteomyelitis, da kompositten formåede at levere gatifloxacin langsomt og viste tilstrækkelig bakteriel aktivitet in vitro mod Streptococcus milleri og Bacteroides fragilis, mikroorganismer, der er ansvarlige for osteomyelitis. Efter kun 4 ugers implantation lykkedes det også GFLX-belastet PLGA og βTCP at reducere inflammationen betydeligt og støtte osteokonduktionen og vaskulariseringen af de behandlede steder i kaninens underkæbe . Desuden er steriliseret PLGA-stillads et lovende materiale til fremstilling af vævsteknologisk fremstillet buccal mucosa . Desuden kan PLGA-kompositter med biokeramiske materialer anvendes til direkte pulpacapning enten ved at inkorporere vækstfaktorer i PLGA-mikropartikler eller ved direkte pulpacapning med PLGA-kompositter af mekanisk udsatte tænder . Der blev imidlertid ikke observeret noget hårdt væv ved direkte pulpacapning med PLGA, og der var tydelig pulpanekrose på grund af PLGA’s lave adhæsion til pulpan på trods af den viste biokompatibilitet i celletesten . PLGA-kompositter med biokeramiske materialer er således fortsat en bedre mulighed end PLGA alene til pulpacapning med bedre vævsrespons sammenlignet med calciumhydroxid . De lovende resultater af PLGA-materialerne tyder på, at der er behov for yderligere undersøgelser, primært inden for afgivelse af stoffer til tandvæv eller vedrørende PLGA-kompositmaterialernes evne til at dække pulpa.
3. PLGA-membraner
En række polymere bioresorbable membraner anvendes i knogleregenerationsteknikker, fordi de muliggør procedurer i ét trin, hvilket reducerer patientens ubehag og omkostninger og potentielle kirurgiske komplikationer . Der opnås også en større knogleregeneration, når en membran anvendes i parodontalbehandling . I lyset heraf er PLGA-membraner blevet undersøgt med lovende resultater, enten alene eller, for nylig, kombineret med andre materialer. Tabel 1 viser de mange forskellige dyre- og menneskeundersøgelser vedrørende PLGA-membraner i tandplejen.
|
PLGA-membraner blev undersøgt med henblik på parodontal regeneration. Skalerings- og rodplanlægningsprocedurer efterfulgt af anbringelse af PLGA-membraner resulterede i betydelig klinisk tilknytning og knogletilvækst i defekter distalt for de mandibulære andenmolarer , mens en bioaktiv og resorberbar PLGA-membran for nylig er blevet anvendt i calvariale defekter for at forbedre knogleheling hos kaniner . Tilsætning af forskellige aktive stoffer til PLGA-membraner førte til forbedrede resultater. Således blev PLGA-membran, som var belagt med en atelocollagen-gel med rhBMP-2, anvendt til rekonstruktion af transsektioner og defekter i underkæben, og de histologiske analyser tyder på, at PLGA-membranen gradvist blev absorberet og erstattet af fibrøst bindevæv eller knoglevæv . Desuden er PLGA-transporterede hyaluronsyre-billedlagsfilm blevet testet med succes til styret knogleregeneration hos rotter, hvilket førte til 63,1 % dækning af knogledefektområdet uden negative virkninger . Hyaluronsyre-PLGA blev syntetiseret i form af 150 nm nanopartikler og derefter inkorporeret i en HA-PLGA-billedlagsblandingsfilm på 33 mikron, som blev fuldstændig nedbrudt og absorberet fuldstændigt i løbet af 12 uger . Der blev også fremstillet kombinerede makroporøse bioresorbable membraner til knogleheling af en kombination af poly-mælkesyre-co-glycolsyre-co-ε-caprolacton (PLGC) . I en 6-måneders undersøgelse på hundeunderkæben blev der anvendt forskellige PLGC-membraner alene eller forstærket med titanium, og alle viste mere knogle end kontrollerne, selv om membranerne blev anvendt alene eller sammen med autologt knogle . I nyere undersøgelser blev der anvendt PLGA-membraner behandlet med iltplasma og med SiO2-nanopartikler, som det lykkedes at fremme 59 % knogelnydannelse i langt højere grad end PLGA-membraner alene i et nyere forsøg på kaniners kranie.
Andre undersøgelser fokuserede på in vivo-adfærden af forskellige membraner såsom kollagen, polylactid/polyglycolidcopolymer og citronsyrecopolymer. Resultaterne viser ingen statistiske forskelle mellem disse membraner . Desuden førte PGA/PLA-polyglycolsyre/polymyresyre-copolymermembranen til relativt ensartede resultater sammenlignet med anvendelsen af kollagenmembraner . Desuden blev der ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle, når der blev anvendt bindevævstransplantater i stedet for PLGA-membranerne , hvilket tyder på, at der blev opnået bedre resultater, når der blev tilsat hydroxyapatit til polymermembranen . En nyere undersøgelse af 40 patienter konkluderede, at PLGA-membranen var i stand til at vurdere knogleregenerationen med succes, men at kontrollen viste bedre resultater med hensyn til at bevare den horisontale tykkelse af regenereret knogle og afslørede færre blødtvævskomplikationer . Samlet set synes processen med at tilsætte knoglefremmende faktorer eller andre materialer til PLGA-membranerne at forbedre resultaterne af knoglevævsregenerering.
4. PLGA-scaffolds
PLGA-scaffolds anvendes i øjeblikket som selvstændige biomaterialer, celledragere eller lægemiddeltilførselsanordninger . Forskning i medicin nyder godt af udviklingen af PLGA-stilladserne, der finder mange potentielle anvendelser inden for områder som regenerering af hjertevæv , sårheling , styret knogleregeneration af knoglevæv , levering af vækstfaktorer og gener og dyrkning af stamceller . I de seneste år er der inden for knoglevævsteknologi gjort en stor indsats for at udvikle bionedbrydelige stilladser med både fremragende biokompatibilitet og mekaniske egenskaber, der efterligner dem fra naturligt knoglevæv . PLGA-stilladser er blevet anvendt til regenerering af beskadiget væv, f.eks. ved knogledannelse eller i regenerativ tandpleje sammen med stamcellebaseret terapi . Tabel 2 viser undersøgelser vedrørende anvendelsen af PLGA-stilladser i knogleheling og -regeneration. Der blev opnået knogledannelse med PLGA-bærere inkorporeret med autogent knogletransplantat eller forskellige knoglefremmende stoffer som f.eks. bone morphogenetic protein-2 BMP-2 eller simvastatin . Alveolærkamforøgelse, der er meget nødvendig i tandimplantatbehandling, kunne også drage fordel af PLGA-materialerne , da atrofiske steder blev rekonstrueret ved hjælp af bioresorbérbart PLGA, knogleallotransplantat og et osteoinduktivt protein som rhBMP-2 . Sockets var betydeligt større hos rotter, der blev behandlet efter ekstraktion med PLGA/PEG1, efter kun 4 ugers implantation . Også PLGA-stilladser belastet med simvastatin og SDF-1α fremmede knogleregenerationen betydeligt mere end kontroller i calvarialdefekter hos musekalvarier . Desuden viste tilsætning af rekombinante humane knoglemorfogenetiske proteiner til PLGA-gelatin-svampestilladserne en signifikant større knogledannelse uden immunreaktioner eller andre bivirkninger ved alveolærkamaugmentering hos hunde .
|
Komposit PLGA/CaP-stilladser er også blevet anvendt i knogleregenereringsprocedurer (alene eller i kombination med osteoblastceller ). PLGA/CaP (calciumphosphat) biomateriale i to lag blev anvendt med større parodontal regeneration i klasse II furkationsdefekter hos hunde end traditionelle fleksible membraner, der viste større knoglevolumetriske værdier, trabekulært antal og trabekulær tykkelse . Ud over PLGA/CaP har andre kompositter såsom PLGA/apatitstilladser og PLGA/β-tricalciumphosphat-stilladser vist sig at være bioeffektive til knogledannelse . Der blev dannet betydeligt mere cementum og knogle i parodontale defekter hos hunde efter behandling med rhGDF-5 belagt på beta-tricalciumphosphat (beta-TCP)-partikler og nedsænket i en bioresorberbar poly(lactic-co-glycolsyre)-komposit (PLGA) . Desuden blev PLGA-stilladser alene eller i kombination med celler anvendt til augmentering af bihulehulen i overkæben. Knogleregenerering blev opnået ved at udså knoglemarvsmesenkymale stamceller fra knoglemarv eller stamceller fra tandpulpastamceller på en PLGA-stillads . Desuden har PLGA/hydroxyapatitstilladser vist sig at fremme celleproliferation og differentiering af stamceller . Der blev også regenereret knogle ved hjælp af en PLGA/hydroxyapatit-stillads med dedifferentierede fedtceller eller PLGA-kalciumphosphat-stillads med knoglemarvsstamceller . Tilsætning af knoglemarvsstamceller til PLGA-kalciumfosfat-stilladserne viste 20 gange mere knogledannelse end stilladserne alene .
Polymermaterialer er blevet anvendt som stilladser til at styre tandstamcellerne med det formål at skabe tandlignende strukturer. PLGA-materialer er blevet anvendt til regenerering af dentin eller til at fremstille dentinlignende strukturer . Forskere var i stand til at så og dyrke stamceller fra tandpulpa på PLGA-stilladser, og disse stilladser blev transplanteret i kaniner og syntes at producere osteodentinlignende strukturer samt tubulære tolagede strukturer af vertikalt justerede parallelle tubuli, der ligner tubulærlignende dentin . Endvidere gav PLGA/tricalciumphosphat med tandknoppeceller anledning til dentin-lignende og pulpa-lignende væv . Svinetandpulpestamceller blev udsået på PLGA-stilladser og blev implanteret i rottekanaler af ekstraherede tænder, som blev anbragt i friske postekstraktionshulrum hos minisvin . Efter 10 ugers implantation viste den histologiske analyse, at der var nyligt dannet organisk matrix, som konsekvent blev aflejret på kanalvæggene, og at der var et kontinuerligt lag af polariserede eller ikke-polariserede celler med en søjleformet eller spindelformet morfologi . Stromale celler fra fedtvævet på en PLGA-stillads regenererede også knogle-, parodontalligament- og cementlag . Tabel 3 viser de vigtigste anvendelser af PLGA-stilladser inden for regenerativ tandpleje.
|
Og selv om de viser lovende resultater i en række forskellige anvendelser, er PLGA-stillernes biokompatibilitet til debat. Nedbrydningsprodukterne af PLGA (mælke- og glycolsyre) kan sænke pH-værdien i det omgivende væv og forårsage inflammation eller fremmedlegemsreaktioner in vivo . De sure nedbrydningsprodukter har også potentiale til at hæmme dannelsen af apatitkrystaller , hvilket formentlig fører til mangelfuld osteointegration. De hydrofobiske egenskaber ved de bioresorbable polyestere har en negativ indflydelse på deres celleadhæsion . I et forsøg på at reducere inflammationen og forbedre PLGA’s biokompatibilitet er der desuden med lovende resultater blevet inkorporeret forskellige partikler i PLGA-materialerne: titaniumnanopartikler , tripolyphosphatnanopartikler , demineraliserede knoglepartikler og nanoapatitpartikler . PLGA-stilladserne blev også funktionaliseret med fibronectin, og PLGA-fibrene blev belagt med apatitlag . Et andet problem er det faktum, at spytfødte aerobe og anaerobe mikroorganismer klæbede betydeligt mere til PLGA sammenlignet med andre polymere (PLLA og PLLA-TCP) stilladser. E. faecalis (en bakterie, der forekommer i tilbagevendende endodontiske infektioner) og P. gingivalis (et parodontitisrelateret patogen) viste den højeste adhæsion til PLGA-stilladset, hvilket giver anledning til bekymring om mulige implantatrelaterede infektioner .
5. PLGA-mikropartikler
Konceptet om at anvende polymerbaserede systemer til langtidsfrigivelse til at opretholde terapeutiske lægemiddelkoncentrationer i længere perioder er accepteret i årtier . Mikropartikler og nanopartikler foretrækkes frem for andre metoder som følge af deres fleksibilitet i forbindelse med fremstilling og anvendelse . Flere medicinske anvendelser af PLGA-mikropartikler omfatter genafgivelse , kræftbehandling og vacciner . PLGA-mikropartikler er blevet undersøgt med succes inden for en lang række dentale områder, såsom endodontisk terapi , vaccination mod caries , regenerativ tandpleje , tandkirurgi eller parodontologi . Tabel 4 opsummerer også de vigtigste anvendelser af PLGA-mikropartikler inden for tandpleje.
|
I endodontikken kunne PLGA- og zein-mikrosfærer levere amoxicillin i betydelige mængder i rodkanalen og overvinde de koncentrationsniveauer, der er nødvendige for en passende endodontisk desinfektion . Amoxicillin blev valgt, fordi det er effektivt mod Enterococcus faecalis, en mikroorganisme, der er ansvarlig for endodontisk svigt og er mest resistent over for rodkanalpræparation og intrakanale forbindinger . Desuden kan PLGA-mikrosfærer inkorporeret med rekombinant Streptococcus mutans glucanbindende protein D (rGbpD) give anledning til en fremtidig dental vaccine, som en undersøgelse af immuniserede rotter behandlet med chitosan-belagte PLGA-mikrosfærer viser. Vækstfaktorer inkorporeret i PLGA-mikrosfærer inducerer dannelsen af tertiær dentin , mens trombin-belastede poly(D,L-lactid-co-glycolid)-mikrosfærer dannede en ny bionedbrydelig hæmostatisk anordning . Parodontologi kan også drage fordel af PLGA-mikropartiklernes kontrollerede leveringsegenskaber. En lang række stoffer er blevet inkorporeret i PLGA-bærerne og langsomt frigivet lokalt med henblik på parodontal behandling og regeneration: tetracyklin , doxycyklin eller klorhexidin . PLGA-mikrosfærer inkorporeret med hydroxyapatit og ofloxacin blev fremstillet til brug som et lokalt lægemiddelafgivelsessystem til parodontitisbehandling og viste gode resultater mod S. aureus og E. coli , mens PDLLA-PLGA-mikropartikler fyldt med vækst- og differentieringsfaktorer var i stand til at fremskynde osteogenese, knoglemodning, fibersammenlægning og cementogenese af det parodontale apparat i rotternes overkæbe . Knogleregeneration er det tandlægeområde, som de fleste undersøgelser vedrørende PLGA-mikropartikler koncentrerer sig om. Intracellulær levering af østrogen (et kønssteroid, der øger knogledannelsen) ved hjælp af kationiske PLGA-mikropartikler opregulerer signifikant den osteogene differentiering af humane mesenkymale stromale celler fra knoglemarv ved at forbedre udtrykket af de osteogene differentieringsmarkører ALP og Cbfa-1 efter 1 og 2 uger . PLGA-mikrosfærer, der indeholder simvastatin , vækstfaktorer eller dexamethason, forbedrede knogledannelsen betydeligt. PLGA-mikropartikler fyldt med vækstfaktorer blev også anvendt til bedre osteointegration af titaniumimplantater, mens PLGA-mikrosfærer med biphosphonat kan anvendes i fremtiden til behandling af alveolær knogleresorption . Injicerbare PLGA-mikrosfærer indeholdende fluvastatin blev udviklet til at forbedre osteogenesen omkring titaniumimplantater i skinnebenet hos rotter, og efter en enkelt injektion stimulerede PLGA-mikrosfærerne med fluvastatin sikkert knogledannelsen omkring titaniumimplantater og øgede knoglens mekaniske egenskaber . Den biomekaniske fastholdelse af implantater blev forbedret efter tilsætning af PLGA-mikropartikler fyldt med insulin, som det blev konkluderet i en dyreundersøgelse på type I-diabetiske rotter . Desuden blev PLGA-mikropartikler anvendt til bedre osseointegration af titanimplantater, også hos diabetiske rotter af type II , da insulinlignende vækstfaktor I blev langsomt frigivet i 30-40 dage af PLGA-mikropartikler og førte til knogleaflejring omkring grænsefladen af titanimplantater . Et stillads inkorporeret med PLGA-mikropartikler fyldt med et knoglemorfogenetisk protein (rhBMP-2) var mere effektivt til at fremkalde osseointegration af implantater end det samme stillads med proteinet direkte indkapslet uden PLGA-mikropartikler . Brugen af mikropartikler gav også anledning til en række praktiske problemer. Da partiklerne blev undersøgt i forbindelse med implantatbehandlingsprocedurer, rapporterede nogle forfattere således om tab af PLGA-stofferne under implantatplaceringen. Forskellige tilgange, såsom indsættelse af blod blandet med PLGA-mikrosfærer i implantathullet eller tilføjelse af blod blandet med PLGA på titanimplantaterne , viste et betydeligt tab af PLGA-mikropartikler på grund af den mekaniske friktion.
Den mangfoldighed af dentale anvendelser, hvor PLGA-partikler kan anvendes, er opmuntrende. De lovende resultater inden for knogleregenerationsområdet og parodontologi kan kræve yderligere undersøgelser og kliniske forsøg. Samlet set synes mikropartikler af polylactic-polyglycolsyre at være en lovende kontrolleret leveringsanordning i tandbehandling.
6. PLGA-nanopartikler
Mikropartikler og nanopartikler er hovedsageligt designet som målrettede lægemiddelafleveringssystemer med det formål at minimere de bivirkninger, der er forbundet med brugen af frie lægemidler. Der er blevet anvendt forskellige udtryk til at beskrive nanopartikler: nanocarrierer, nanovæsker, nanosystem, nanodisc, nanovorm, nanorod, nanorør, lægemiddel-polymer-konjugater, lægemiddel-protein-konjugater, liposomer, polymermikeller, dendrimere og lægemiddel-nanokrystaller . Nanopartikler giver en lang række fordele som f.eks. mindre partikelstørrelse, der letter indtrængningen i cellerne, højere indfangningseffektivitet for øget frigivelse af lægemiddelstoffer, lavere mindste hæmmende koncentration og minimale bakteriekoncentrationer, hvilket betyder, at der opnås en bedre antibakteriel aktivitet med en mindre mængde lægemiddel . På det medicinske område er PLGA-nanopartikler blevet udviklet som genbærere, og de er også blevet undersøgt indgående som vaccinetilførselssystemer eller i forbindelse med kræftbekæmpelse. Målrettede PLGA-nanopartikler, men ikke mikropartikler, leverer specifikt antigen til humane dendritiske celler.
Nanopartikler af PLGA kan anvendes til en lang række forskellige anvendelser inden for tandlægevidenskab, som vist i tabel 5. Minocyclin-belastede PLGA-nanopartikler viste bedre antibakteriel aktivitet end brugen af frit minocyclin og kan udgøre et potentielt bæresystem til transport af antibiotika til parodontale væv. Hæmningszonen for minocyclin-belastede nanopartikler (9,2 mm) var større end for frit minocyclin (3,5 mm) mod Aggregatibacter actinomycetemcomitans, det vigtigste patogen i parodontale infektioner . Desuden udviste methylenblå belastede PLGA-nanopartikler en større fotodynamisk effekt end fri MB og udviste ca. en størrelsesorden af aflivning af E. faecalis biofilm-arter (en mikroorganisme, der findes i endodontiske fejl) i eksperimentelt inficerede rodkanaler af menneskelige ekstraherede tænder . PLGA-nanopartikler fyldt med methylenblåt udviste også en større fotodynamisk virkning end fri MB i suspensioner af bakterier fra human tandplak samt i biofilm indsamlet fra 14 patienter med kronisk parodontitis . Så PLGA-nanopartikler fyldt med methylenblå fotosensibilisator kan bruges til endodontiske infektioner såvel som til reduktion af bakterier i menneskelig tandplak, der findes hos patienter med kronisk parodontitis . Desuden bidrager PLGA-nanopartikler til betydelige forbedringer af knogleregenereringsteknikkerne ved at levere vækst- og differentieringsfaktorer med lovende resultater. Levering af PLGA-nanopartikler fyldt med knoglemorfogenetisk protein-2 til mesenkymale stamceller fra knoglemarven inducerede langt mere omfattende knogledannelse in vivo end enten implantation af nanopartikler fyldt med BMP-2 alene eller osteogent differentierede stamceller . PLGA-nanopartikler indeholdende simvastatin blev også anvendt til at øge osteogenese af knoglemarvets mesenkymale stamceller, som kan anvendes yderligere til knogleregeneration . Nanopartikler af PLGA med vækstfaktor er også blevet anvendt med succes i implantatbehandling, idet de stimulerer knogledannelsen ved siden af overfladen af et tandimplantat, der er indsat i knogle . Den histomorfometriske analyse viste en gennemsnitlig kontaktprocent mellem knogle og implantat på 44 % efter kun 12 ugers implantation i skinnebensknogler fra kaniner . Resultaterne af disse undersøgelser er lovende, men der er behov for yderligere eksperimenter for at teste virkningerne af anvendelsen af nanopartikler af PLGA i tandbehandlinger.
|
7. PLGA Begrænsninger
Sammenfattende har PLGA-membraner til dato kontroversielle resultater, når de anvendes alene i knogleregenerationsbehandling . Nogle forfattere foreslog, at PLGA har begrænsede gavnlige virkninger i knogle- og parodontal regeneration. Desuden synes orale mikroorganismer (såsom S. mutans, E. faecalis, P. nigrescens, P. gingivalis, S. sanguis og C. albicans) at have en god vedhæftning til PLGA-stilladserne in vitro, og dette kan resultere i bakterierelaterede infektioner in vivo . Forskningen bør intensiveres og udvides for at overvinde de praktiske problemer, der er opstået i forbindelse med manipulation af PLGA-mikropartikler . Og vi må også tage hensyn til de utilstrækkelige data vedrørende PLGA-nanopartikler på det dentale område.
8. Konklusioner
På grund af deres biokompatibilitet er PLGA-materialer blevet undersøgt med succes inden for næsten alle dentale områder, fra endodontik til parodontologi og implantologi. De lovende resultater af in vitro- og in vivo-forsøgene tyder på, at der bør gennemføres yderligere undersøgelser vedrørende PLGA-anvendelser inden for dental forskning.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Anerkendelser
Bogdan Calenic anerkender, at denne artikel er delvist støttet af det sektorspecifikke operationelle program for udvikling af menneskelige ressourcer (SOPHRD), der finansieres af Den Europæiske Socialfond og den rumænske regering i henhold til kontrakt nr. POSDRU 141531. Daniela Miricescu vil gerne takke Young Scientist Grant 2014-2016, som hun har modtaget fra University of Medicine and Pharmacy Carol Davila, Bukarest, Rumænien. Maria Justina Roxana Virlan erkender, at denne artikel er delvist støttet af det sektorspecifikke operationelle program for udvikling af menneskelige ressourcer (SOP HRD), der finansieres af Den Europæiske Socialfond og af den rumænske regering i henhold til kontrakt nr. SOP HRD/159/1.5/S/135760.