4.04.4.4.2 Aroma og forureninger i fisk
I forbindelse med anvendelsen af flygtige ekstraktionsteknikker blev der udviklet en hurtig og nem metode til bestemmelse af visse forureninger som f.eks. 2-phenoxyethanolrester i fiskevæv og blodplasma48 og efterfølgende anvendt metoden til overvågning af dynamikken af 2-phenoxyethanolrester i fisk behandlet med anæstetika.
2-phenoxyethanol (ethylenglycolmonophenylether, C8H10O2) er et lovende bedøvelsesmiddel, der anvendes i fiskeri og akvakultur.
Der blev udviklet en ny procedure, der anvender fastfasemikroekstraktion (SPME) af målanalytten fra prøvens headspace efterfulgt af gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)48 . Både prøvehåndteringen, der sigter mod maksimal overførsel af 2-phenoxyethanol til headspace, og SPME-GC-MS-betingelserne blev omhyggeligt optimeret.
Til optimeringen blev forskellige prøveforberedelses- og SPME-betingelser afprøvet.48
Vævsprøver fra fisk, der ikke var udsat for 2-phenoxyethanol, blev anvendt til at udvikle og karakterisere SPME-metoden. Spikede prøver uden matrixmodifikation blev fremstillet på følgende måde: Der blev tilsat 5 μl arbejdsstandarder til 2 g formalet fiskevæv for at opnå et endeligt spiking-niveau på 3-382 mg kg-1.
Derpå blev flere alternative matrixmodifikationer afprøvet: (I) 2 g af enten spiked væv eller væv med påførte rester blev overført til et 10 ml headspace (HS) hætteglas, hvortil der derefter blev tilsat 2 ml ultrarent vand; (II) 2 g væv med påførte rester blev formalet med 2 g natriumsulfat; og (III) 2 g væv med påførte rester blev formalet med 2 g natriumsulfat og derefter nedsænket i 3 ml ultrarent vand i et 10 ml HS-hætteglas. Alle modificerede prøver blev rystet kraftigt i 20 min. før SPME-analysen.
For at identificere den fiber, der er mest effektiv til analytudtrækning, blev tre kommercielt tilgængelige SPME-fibre (PA, PDMS/CAR/DVB og CW/DVB) med forskellig selektivitet i den stationære fase evalueret. Et fiskevæv (umodificeret) tilsat 33 mg kg-1 fungerede som kontrol i disse fiber-testforsøg.
Alle ekstraktioner blev udført under de samme betingelser (60 min sorption ved 30 °C). Der blev opnået utilfredsstillende resultater med hensyn til ekstraktionseffektivitet (baseret på detektorrespons, dvs. sammenligning af signal/støjforholdet) ved brug af PA- og CWX/DVB-fibre. Den blandede PDMS/CAR/DVB-fiber gav de bedste resultater og blev derfor anvendt i vores efterfølgende forsøg.
Der blev gennemført forsøg med fokus på dynamikken i 2-phenoxyethanolekstraktionen med 5, 15, 30, 40 og 60 min. ekstraktionstid ved 30 °C. Eksperimenterne blev udført med prøver af fiskevæv, der var tilsat 1 mg kg-1. Mængden af ekstraheret analysand steg kontinuerligt i løbet af ekstraktionstiden. For at bevare laboratorieprøvernes gennemstrømning på et acceptabelt niveau blev der ikke overvejet nogen yderligere forøgelse af ekstraktionstiden. Ekstraktionstiden på 60 min blev valgt til yderligere analyser.
Med anvendelse af en divinylbenzen/Carboxen/polydimethylsiloxan (PDMS/CAR/DVB)-fiber til 60 minutters prøveforberedelse ved 30 °C og en ionfældedetektor i MS/MS-tilstand opnåede Klimancova et al.48 detektions- (LOD) og kvantificeringsgrænser (LOQ) på henholdsvis 0,03 og 0,1 mg kg-1 af prøven. Metoden var lineær i et område på 0,1-250 mg kg-1 , og afhængigt af prøvematrixen og spikingniveauet blev der opnået en repeterbarhed (udtrykt som relativ standardafvigelse, R.S.D.) på mellem 3 og 11%.48
Organiske kviksølvforbindelser, hvoraf methylkviksølv er den mest almindelige, er af særlig betydning på grund af deres øgede toksicitet. Som svar på den stigende efterspørgsel er der i løbet af det seneste årti blevet udviklet adskillige analyseteknikker til at artsbestemme organomercurialer i biologiske prøver.
For nylig er fastfase-mikroekstraktion (SPME) blevet en udbredt opløsningsmiddelfri teknik til GC-bestemmelse af organometallics. SPME giver ikke blot mulighed for et hurtigt, opløsningsmiddelfrit, integreret prøveekstraktions-prøveindføringssystem, men kan også give en bedre prækoncentration af analysanden end væske-væskeekstraktionsteknikker (LLE). Ved anvendelse af headspace (HS)-prøveforberedelsesteknikken kan der desuden også foretages matrixseparation baseret på volatilitetsforskelle mellem analysanden og andre forbindelser, der er til stede i prøveopløsningen. Det skal dog bemærkes, at andre integrerede opløsningsmiddelfrie ekstraktions-prækoncentreringsmetoder, dvs. metoder, hvor der anvendes purge-and-trap-teknikken eller sorptiv ekstraktion med omrøringsstang (SBSE), også er attraktive alternativer til SPME til forskellige organometalliske bestemmelser.
Der blev foreslået anvendelse af en omkostningseffektiv analysemetode (SPME-GC-pyrolyse-AFS-system) til bestemmelse af MeHg i typiske diætprøver af fisk og skaldyr.49 Undersøgelsen fokuserede på at undersøge de nødvendige modifikationer af veletablerede metoder, der involverer alkalisk fordøjelse, med henblik på at anvende phenylering i vandig fase og SPME-prøveforberedelse til analyse af fødevareprøver med komplekse matricer indeholdende MeHg i intervallet 100 ng g-1.
Probeforberedelsesprocedure: 250 mg lyofiliseret og formalet prøve eller certifikatreferencemateriale (CRM) blev nøjagtigt afvejet i en ren glaskolbe på 30 ml, og der blev tilsat 5-6 ml 25% (w/v) KOH i methanol eller 18% (w/v) NaOH i methanol (begge var 4,5 M). Derefter blev hætteglasset forseglet med et PTFE-foret skruelåg og anbragt i et ultralydsbad i 3 timer ved 75 °C. Efter at hætteglasset var blevet afkølet til omgivelsestemperatur, blev proceduren varieret afhængigt af prøvens MeHg-indhold. I tilfælde af prøver med et højt indhold (med et indhold på få μg-1 MeHg i forhold til tørvægt) blev hele opkoget skyllet grundigt over i en 50 ml målekolbe. Fra denne opløsning blev 1 ml pipetteret over i en 10 ml målekolbe.
Hvis der skulle anvendes standardtilsætningsmetoden, blev der også tilsat 1 ml vandig MeHgCl-standard til opløsningen, inden den blev fortyndet til det nominelle volumen. Standardtilsætningsniveauerne svarede til resultatet 1×, 2× eller 4× den forventede analytkoncentration i prøveopløsningen.
For prøver med lavt indhold (indeholdende kun ca. 100 ng g-1 MeHg eller mindre) blev opløsningen, efter at hætteglasset var blevet afkølet til omgivelsestemperatur, rystet i nogle få sekunder, og derefter blev 5 ml pipetteret over i et 6 ml glascentrifugeringsglas. Opløsningen blev centrifugeret i 15 min. ved 4100 g og 20 °C. Fra supernatanten blev 1 ml overført til en 10 ml målekolbe, og standardtilsætningsmetoden blev udført som beskrevet ovenfor.
I begge tilfælde blev 1 ml af de 10 ml fortyndede (og spikede) opløsninger pipetteret over i 30 ml glaskolber, der hver indeholdt 10 ml af en 1 M, pH = 5 acetatbuffer. På dette tidspunkt blev der anbragt en ren PTFE-belagt omrøringsstang i beholderen. Endelig blev der tilsat 1 ml frisk fremstillet 1% NaBPh4, og glasset blev straks forseglet med et skruelåg forsynet med en PTFE-belagt gummiskillevæg. Beholderen blev anbragt på en magnetisk omrøringsplade, og under kraftig omrøring (700 rpm) blev der foretaget headspace SPME-ekstraktion. Fiberen blev belagt med en 100-μm film af poly(dimethylsiloxan) (PDMS). Efter ekstraktionen blev fiberen indført i GC’ens opvarmede indgangsport til termisk desorption og pyrolyse-AFS-bestemmelse.
Det samlede Hg-indhold i prøverne blev bestemt med direkte kviksølv ved hjælp af 100 mg fast prøve og ekstern kalibrering.49
En anden teknik til bestemmelse af methylkviksølv i fiskevæv bestående af GC-ICP-MS-system med en SPME-teknik (PDMS) til ekstraktion af analysanden blev foreslået.41
Probeforberedelse: 0,25 g prøve med en passende mængde beriget MM198 Hg-spike og 20 ml 25% (m/v) methanolisk KOH-opløsning blev rystet i 5 timer og derefter opbevaret ved 4 °C indtil analysen. Der blev fremstillet seks kalibreringsprøver med omvendt spike-isotopfortynding for at kvantificere koncentrationen af den berigede MM198 Hg-spike. Et volumen på 0,200 ml af den berigede MM198 Hg-spikeopløsning og 0,240 ml af 2,042 μg ml-1 (eller 1,993 mg ml-1) af opløsningen af mmHg med naturlig forekomst blev nøjagtigt pipetteret i en hætteglasbeholder og fortyndet med methanol til 10 ml. Til SPME headspace-prøveforberedelse blev kun et volumen på 100 ml af en opkognings- eller reverse spike isotopfortyndingskalibreringsprøve (på grund af den høje følsomhed af SPME GC-ICP-MS) overført til en 50 ml glaskolbe til kvantisering.
Når 20 ml 1 mol l-1 NaAc-bufferopløsning og 1 ml 1% NaBPr4 var tilsat, blev kolben lukket med en PTFE-belagt silikonegummisekptum. SPME-nålen blev ført ind gennem septummet, og der blev foretaget headspaceprøveforberedelse i 10 min. Under ekstraktionen blev opløsningen omrystet kraftigt med en teflonbelagt magnetomrøringsstang. Den opsamlede analysand blev derefter desorberet fra SPME-fiberen til GC-kolonnen.41